酸性成纤维细胞生长因子基因真核表达载体的构建及转染肌卫星细胞

目的 探讨通过构建酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)基因真核表达载体转染大鼠肌卫星细胞(MSCs)建立细胞工程种子细胞可行性.方法 首先提取人类肌肉组织总RNA,RT-PCR法调取aFGF基因,然后用直接化学合成法合成人类白细胞介素2信号肽序列(SPS),通过基因融合得到SPS-aFGF,再通过定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1,最终得到重组质粒PEGFP-N1-SPS-aFGF,对重组质粒做测序和酶切鉴定;差速贴壁法获取大鼠MSCs,观察细胞形态,做免疫荧光鉴定;经鉴定正确的细胞随机分为3组:目的基因组(aFGF加N1)、空载质粒组(N1)、空白对照组(blank),前两组分别加入质粒PEGFP-N 1-SPS-aFGF与pEGFP-N1质粒,空白对照不加入任何质粒,均在脂质体Lipofectamine 2000TMReagent介导下转染,转染后荧光显微镜统计发绿色荧光的细胞占各组细胞比例,计算转染效率;转染72h后利用实时荧光定量PCR与Western blot检测aFGF基因在MSCs中表达情况.结果 ①重组质粒测序结果与GenBank公布的序列一致,酶切鉴定条带与实际大小相符.②荧光显微镜下观察到转染细胞有荧光表达,并在转染72 h达到最高峰.③转染后72 h,实时荧光定量PCR结果显示目的基因组表达量平均相对比值(aFGF加N1)组(1464.96)显著高于N1组(1.016)、Blank组(1.000),差异有统计学意义(P＜0.05).Western blot检测显示aFGF表达呈极强阳性,而N1组及Blank组aFGF表达极弱.结论 成功构建aFGF基因真核表达载体并转染MSCs,aFGF在MSCs内高表达,此种方法有希望获取具备特殊生物学功能细胞.

Construct eukaryotic expression vector with aFGF gene and transfect muscle satellite cells