CD105特异性shRNA表达质粒的构建和筛选

目的:使用Pgenesil-1质粒构建CD105RNA干扰重组体,在激光诱导BN大鼠脉络膜新生血管模型中,筛选高效抑制CD105基因表达的shRNA。方法:根据CD105基因序列信息设计了3条shRNA以及1条非特异阴性序列,利用含U6启动子的表达质粒Pgene-sil-1构建其RNA干扰重组体。采用视网膜下注射的方法使shRNA表达质粒转染大鼠视网膜和脉络膜,观察质粒所携带绿色荧光蛋白基因表达情况。根据不同的表达质粒对BN大鼠CNV模型2wk时CD105基因mRNA表达的抑制效果与空白对照及仅加转染试剂组比较分析,筛选有效的抑制序列。结果:转染后1d,在荧光显微镜下可见有明显的绿色荧光分布于实验眼视网膜全层,包括RPE层。2~3wk荧光强度比1wk增强,并持续表达4wk。空白对照眼无绿色荧光表达。构建了3条CD105shRNA和阳性对照Pgenesil-HK,基因测序证实目的序列成功插入质粒Pgenesil-1中。研究发现不同的质粒转染后对CD105在CNV高峰期的表达干预效果不同。Pgenesil-eng2和Pgenesil-eng3可明显抑制CNV模型在2wk时CD105mRNA的表达,抑制效率分别为(78±5)%(P<0.01);(52±3)%(P<0.01)。转染Pgenesil-eng1,Pgenesil-HK组及仅加转染试剂组与空白对照组相比CD105mRNA表达水平无明显变化。结论:在阳离子脂质体辅助下,Pgenesil-1质粒可以成功地将目的基因转染至大鼠视网膜各层次,且表达强度高,时间长于4wk。Pgenesil-eng2能明显抑制BN大鼠视网膜组织CD105mRNA的表达。

Construction and screening of shRNA expression plasmids targeting CD105