腺病毒介导IκBα基因在体外培养U937细胞中的表达及效应研究

目的通过构建IκBα基因的腺病毒表达载体,并用急性相反应蛋白SAA3启动子来指导目的基因IκBα的表达,体外观察在炎性刺激后IκBα蛋白的诱导性表达特性及对NF-κB活性的调控作用,对炎症介质产生的抑制效应. 方法采用DNA重组与同源重组技术,构建含只响应病理信号的启动子-急性相反应蛋白启动子SAA3、目的基因IκBα的炎症诱导性复制缺陷型重组腺病毒载体(AdIκBα).应用AdIκBα,选择在炎症反应中具有代表意义的巨噬细胞,观察AdIκBα在体外培养巨噬细胞U937中诱导性表达IκBα (Western blot)、对NF-κB活性的调控(EMSA)及体外效应.结果①成功构建炎症诱导性IκBα表达质粒(pAdpLpl SAA3 NLS IκBα),该表达框含SAA3启动子,SV40大T抗原核定位信号(NLS),IκBα cDNA和ploy A; ② pAdpLpL SAA3 NLS IκBα质粒与pJM17同源重组,脂质体(DOTAP)介导,共转染入293细胞.PCR法筛选阳性克隆,获得重组腺病毒(Ad IκBα); ③用293细胞扩增Ad IκBα;采用反复冻融法纯化腺病毒,获得高滴度(5×1010 pfu/ml)重组腺病毒; ④体外实验,用50 MOI Ad IκBα预感染体外培养的U937细胞,再用LPS攻击后,该腺病毒诱导性表达IκBα蛋白(Western blot),且表达的IκBα能抑制NF-κB的活化(EMSA)、下调LPS攻击后TNF-α、IL-6的产生.结论该IκBα腺病毒表达载体通过调控NF-κB活性,可调控炎症介质(TNF-α、IL-6)的产生,用于调理细胞的炎症反应.