大黄灵仙方调控TAK1与TRAF6相互作用及共定位对胆管细胞炎症反应的影响

目的 观察大黄灵仙方（DHLX）对大鼠胆管上皮细胞的修复作用，探讨其作用机制是否通过调节转化生长因子-β（TGF-β）激活激酶1（TAK1）与肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）的相互结合，调控核转录因子-κB（NF-κB）/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路活化而发挥作用。方法 将20只SD大鼠随机分为正常组和DHLX组，分别予生理盐水及DHLX（320 mg·kg^-1·d^-1）灌胃8 d，制备正常血清及含DHLX血清；从正常SD大鼠中提取胆管上皮细胞，取胆管上皮细胞分为9组：正常组、模型组（20 mg·L^-1）、脂多糖（LPS）+DHLX组（20 mg·L^-1+10%含药血清）、LPS+PDTC组（20 mg·L^-1+200 μmol·L^-1）、LPS+SB203580组（20 mg·L^-1+0.5 μmol·L^-1）、LPS+PDTC+SB203580组（20 mg·L^-1+200 μmol·L^-1+0.5 μmol·L^-1）、LPS+PDTC+DHLX组（20 mg·L^-1+200 μmol·L^-1+10%含药血清）、LPS+SB203580+DHLX组（20 mg·L^-1+0.5 μmol·L^-1+10%含药血清）、LPS+PDTC+SB203580+DHLX组（20 mg·L^-1+200 μmol·L^-1+0.5 μmol·L^-1+10%含药血清）；显微镜下观察药物干预后各组细胞的形态学变化，采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测各组细胞中白细胞介素（IL）-1β与IL-6的表达量；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测各组细胞中TAK1与TRAF6蛋白表达水平，免疫共沉淀技术检测TAK1与TRAF6的相互作用，激光共聚焦显微镜观察TAK1与TRAF6在细胞中的分布及共定位情况。结果 LPS作用后，细胞突触减少，胞体变圆变小，用药后各组细胞形态趋向正常；与正常组比较，模型组IL-1β和IL-6表达量明显上升（P<0.05），TAK1表达量降低而TRAF6的表达量升高（P<0.05），TAK1-TRAF6蛋白质复合物含量呈降低趋势；与模型组比较，LPS+DHLX组IL-1β和IL-6表达量明显降低（P<0.05），TAK1表达量升高而TRAF6表达量降低（P<0.05），TAK1-TRAF6蛋白质复合物含量显著增加（P<0.01），两蛋白共定位于细胞质中；与LPS+DHLX组比较，其余各组IL-1β和IL-6表达量均明显降低（P<0.05，P<0.01），通路阻滞剂干预后各组TAK1-TRAF6蛋白质复合物含量明显降低（P<0.05），通路阻滞剂联合DHLX干预后各组TAK1-TRAF6蛋白质复合物含量明显增加（P<0.05），两蛋白在细胞质中存在共定位但不明显。结论 在LPS诱导的胆管细胞炎症反应中，TAK1与TRAF6相互结合呈减弱趋势，大黄灵仙方可逆转此现象，其作用机制可能与促进TAK1与TARF6的相互结合从而抑制NF-κB/MAPK信号通路活化有关。