重组人骨形态发生蛋白2腺病毒载体的构建与鉴定*

背景：目前报道的重组腺病毒构建方法较复杂，构建周期长，导致重组腺病毒构建的成功率较低。GatewayTM技术是基于λ噬菌体的位点特异性高效重组系统，其构建重组病毒载体具有快捷高效的特点。目的：构建含人骨形态发生蛋白2 基因的重组腺病毒载体，为应用骨形态发生蛋白2 基因治疗的研究奠定基础。设计、时间及地点：单一样本观察，实验于2008-02/06在深圳市第二人民医院中心实验室完成。材料：pOTB7-BMP-2 质粒、HEK293为ATTC产品；BLOCK-iTTM Adenovirus Expression System为Invitrogen产品；大肠杆菌DH5α为Biontex产品。方法：用聚合酶链反应方法扩增骨形态发生蛋白2 目的基因，并插入载体pMD19-T Simple Vector中进行测序分析。将骨形态发生蛋白2 基因亚克隆到穿梭载体pEC3.1(+)中，构建pEC3.1-BMP-2 穿梭质粒，再将其中的表达盒通过重组克隆到pAd/BLOCK-iT™-DEST腺病毒载体中，线性化后转293 细胞进行包装获得重组腺病毒rAd-BMP2。主要观察指标：①目的基因骨形态发生蛋白2 的聚合酶链反应扩增。②重组质粒TS-BMP2 的构建。③重组pEC3.1-BMP2 的构建。④重组pAd-BMP2 的构建。⑤重组腺病毒的制备与鉴定。结果：正确扩增长约1.2 kb的骨形态发生蛋白2 cDNA，并成功地构建其腺病毒载体，经线性化的pAd-BMP2 DNA转染HEK293细胞，包装、扩增后得到人骨形态发生蛋白2 重组腺病毒(rAd-BMP2)，其滴度约为1×1010 PFU/mL，该滴度可满足进一步的骨形态发生蛋白2 成骨作用的研究。结论：成功地构建重组人骨形态发生蛋白2 腺病毒载体。

Construction and identification of recombinant human bone morphogenetic protein-2 gene adenoviral vector