HSP90β干扰和过表达慢病毒载体的构建及其在骨肉瘤细胞Saos-2中的表达 |
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作者姓名: | 舒 雄1 刘辉琦2 杰永生1 郑 蕊1 綦 惠1 陈 磊1 靳少锋1 冉宇靓3 |
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作者单位: | 1.北京积水潭医院/北京市创伤骨科研究所,北京 100035;2.青海大学,青海 西宁 810016;3.国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院,北京 100021 |
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基金项目: | 中国医学科学院医学与健康科技创新工程(编号:2016-I2M-3-013,2017-I2M-3-005) |
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摘 要: | 目的:获得热休克蛋白90β(HSP90β)基因干扰和过表达慢病毒表达系统,并检测其在人骨肉瘤细胞株Saos-2中的表达水平。方法:设计合成shRNA,以慢病毒表达质粒构建HSP90β干扰和过表达载体,酶切电泳、测序技术鉴定载体构建是否成功。重组病毒转染H1299细胞,以嘌呤霉素筛选稳定转染的Saos-2细胞,通过荧光显微镜观察计数获得转染效率。将感染好的细胞分为干扰NC组(NEG-shRNA)、干扰组(shRNA-HSP90β)、过表达NC对照组(NEG-pEZ)及过表达组(pEZ-HSP90β)。通过qRT-PCR 与Western blotting 分别从mRNA 和蛋白表达水平验证目的基因的干扰和过表达水平。结果:插入慢病毒表达载体的基因片段与目的基因的碱基序列完全一致。病毒包装成功后,嘌呤霉素最小致死浓度1 μg/ml,感染复数200,感染人Saos-2的感染效率达80%,其中shRNA-HSP90β组干扰效率为86.35%,pEZ-HSP90β组的mRNA相对表达量增加2.8倍。进一步研究发现,shRNA-HSP90β组较NEG-shRNA组中HSP90β蛋白表达明显降低,pEZ-HSP90β组较NEG-pEZ组HSP90β蛋白表达增加。结论:HSP90β基因干扰和过表达慢病毒载体构建成功,并能够在Saos-2中稳定表达。
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关 键 词: | 骨肉瘤细胞 HSP90β 慢病毒载体 RNA干扰 过表达 |
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