RNA干扰人端粒酶逆转录酶基因抑制Hep-2细胞生长增殖的实验研究

目的探讨RNA干扰人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因对Hep-2细胞生长增殖的抑制作用及诱导凋亡作用。方法根据hTERTcDNA序列构建表达hTERTmRNA特异的、含荧光素基因的shRNA真核表达质粒pshRNA1、pshRNA2。随机选取一段与人类基因无同源性的碱基序列构建表达shRNA的含荧光素基因的质粒pshRNA3。构建不表达shRNA的含荧光素基因的对照质粒pshRNA4。实验分为5组:A(pshRNA1)、B(pshRNA2)、C(pshRNA3)、D(pshRNA4)、E(空白培养液)。酶切后电泳分析鉴定质粒pshRNA1~3。采用共聚焦显微镜检测质粒转染后细胞荧光表达情况;以蛋白印迹法研究hTERT表达变化;以TRAP-PCR ELISA法研究端粒酶活性变化;以四甲基偶氮唑盐(MTT)法、倒置相差显微镜及原位细胞凋亡法观察各质粒抑制细胞增殖及诱导凋亡作用。结果(1)质粒pshRNA1~3SalⅠ酶切后电泳见400bp小带,与预期插入的目的基因大小一致。共聚焦显微镜下见大量的细胞表达绿色荧光。(2)pshRNA1、2转染细胞后hTERT表达显著降低;细胞端粒酶活性明显受到抑制,A组细胞活性为:0·159±0·039、B组细胞活性为0·163±0·028、E组细胞活性为1·512±0·076。A、B组与E组比较,差异均有统计学意义(P<0·01)。(3)与E组细胞吸光度(A)值比较,A、B组细胞各时间点均减小,P值均小于0·01。同等培养条件下,A、B组脱落瓶壁的死亡细胞显著增多,凋亡率明显升高。结论(1)靶向hTERTmRNA的shRNA真核表达质粒能有效转染Hep-2细胞;(2)RNA干扰hTERT能显著地抑制Hep-2细胞的生长增殖并诱导细胞凋亡。