肿瘤坏死因子α在血管内皮细胞向间质细胞转化中的作用

目的 观察TNF-α在血管内皮细胞向间质细胞转化中的作用,探讨纤维化疾病发生的机制. 方法 取健康胎儿脐带,体外酶消化法分离培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),用免疫荧光法进行鉴定.取第3～5代对数生长期HUVEC分别接种于12孔板和6孔板中,均按随机数字表法分为6组:对照组,培养液中不加任何刺激因素;5、10、25、50、100 ng/mL TNF-α组,分别在培养液中添加相应终浓度TNF-α,每组3个样本.培养72 h后倒置相差显微镜下观察各组细胞形态;免疫荧光法检测12孔板中各组细胞凝血因子Ⅷ和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,计算2种因子双阳性细胞数比值及吸光度值比值;RT-PCR检测6孔板中各组细胞钙黏蛋白、α-SMA和Ⅰ型胶原mRNA的表达(以灰度值比值表示).对数据行单因素方差分析及LSD检验. 结果(1)原代培养HUVEC为圆形、短梭形或扁平形,传代后细胞呈铺路石样旺盛生长.经第1、2、3、4、5次传代后HUVEC凝血因子Ⅷ阳性表达率分别为(85.5±1.8)％、(88 1±5 0)％、(93.6±3.7)％、(92.9±4 8)％、(89.5±1.1)％,明显高于原代培养HUVEC的(81.4±3.8)％,F值均为7.481,P值均小于0.05.(2)对照组细胞呈圆形、短梭形或扁平形,细胞间连接紧密;5、10、25、50、100 ng/mL TNF-α组随着TNF-α浓度的增加,细胞形态逐渐向长梭形转变,细胞间连接减少、间隙变大.(3)对照组中凝血因子Ⅷ、α-SMA双阳性细胞数比值和吸光度值比值分别为0.055±0 015、0.078±0 017,均显著低于5、10、25、50、100 ng/mL TNF-α组的0 257±0.106、0 280±0.129、0.505±0 059、0.817±0.035、0.929±0.101和0.437±0 040、0 456±0.097、0 496±0.082、0.787±0 131、0.885±0 087,F值分别为45 009、50.099,P值均小于0.01.(4)5、10、25、50、100 ng/mL TNF-α组细胞中钙黏蛋白mRNA水平分别为0.70±0.05、0.63±0 06、0 60±0.10、0.45±0.16、0 26±0.14,后4组显著低于对照组的0 83±0.03,F值均为11.593,P ＜0.05或P＜0.01.5、10、25、50、100 ng/mL TNF-α组细胞α-SMA和Ⅰ型胶原mRNA水平分别为0.45±0.10、0.51±0.16、0.49±0 12、0.60±0.09、0 76±0.03和0.38±0.18、0.45±0.15、0 52±0 12、0 66±0.17、0.76±0.20,后3组2项指标水平显著高于对照组的0.37±0.14、0 31±0 12,F值分别为7.839、2.898,P ＜0.05或P＜0.01. 结论 TNF-α呈明显浓度依赖性促进HUVEC向间质细胞转化,可能是瘢痕形成中纤维化组织内肌成纤维细胞的又一重要来源.