Luffin-β-KDEL-uPAcs融合毒素的构建及其抗胃癌SGC-7901细胞的活性研究

目的 构建含尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase plasminogen activator,uPA)裂解位点(uPAcs)和KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)驻留信号序列的丝瓜毒素(Luffin-β)基因的原核载体,表达并纯化其融合毒素蛋白Lufin-β-KDEL-uPAcs(LKP),并探讨融合毒素蛋白LKP抗胃癌SGC-7901细胞的活性.方法 RT-PCR两步法克隆Luffin-β基因,引物延伸法构建Luffin-β-KDEL-uPAcs融合基因并亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,诱导其表达融合蛋白Trx-EK-Luffin-β-KDEL-uPAcs (TELKP)并纯化TELKP,肠激酶(enterokinase,EK)切割TELKP后,纯化与回收目的毒素蛋白LKP,SDS-PAGE对LKP蛋白予以检测鉴定,高效液相色谱法(HPLC)对其进行纯度检测.采用cell counting kit-8 (CCK-8)、RT-PCR、Western blot等方法,体外检测毒素蛋白LKP经uPA酶裂解后释放Luffin-β的抗胃癌SGC-7901细胞的活性.结果 成功诱导重组载体pET-32a(+)/Luffin-β-KDEL-uPAcs表达相对分子质量约48.8×103含载体表达标签(Trx)的融合免疫毒素TELKP,EK酶切该蛋白获含290个氨基酸,相对分子质量约31.8×103的目的蛋白LKP.SDS-PAGE检测鉴定表明,LKP蛋白与预期大小一致,其纯度达98.8％.CCK-8、RT-PCR、Western blot等法检测显示,LKP经uPA酶体外裂解可释放具杀瘤活性的Luffin-β小分子毒素.结论 成功克隆到Luffin-β-KDEL-uPAcs融合基因,并将其构建于原核表达载体pET-32a(+)中,且诱导该载体表达了相对分子质量约31.8×103的融合毒素LKP.LKP毒素经uPA酶体外裂解能释放具杀瘤活性的Luffin-β小分子毒素.