| 摘 要： | 目的采用悬浮培养法从人结肠癌细胞HT29中富集结肠癌干细胞,为进一步研究奠定基础。方法 HT29细胞悬浮培养使用添加多种因子的无血清培养基,显微镜下观察微球规则后,胰酶消化,制备单细胞悬液进行传代;用双苯酰亚胺33342荧光染料检测HT29细胞中侧群细胞的比例;采用流式细胞术检测CD133的表达;免疫印迹法(Western blotting)检测ALDH1A1的表达;克隆形成试验检测HT29微球的克隆形成能力。结果 HT29细胞中侧群细胞含量为3.45%±0.05%,经过维拉帕米阻断后,HT29中侧群细胞比例明显减少,差异有统计学意义(P0.01);具有CD133和ALDH1A1表达阳性的细胞,表明存在结肠癌干细胞亚群。HT29细胞悬浮培养24 h,单个细胞以出芽的方式分裂,72 h可见细胞微球体积逐渐增大,7 d细胞团致密微球形态规则,形成漂浮的球体。HT29细胞微球ALDH1A1蛋白表达水平(1.98±0.41)和CD133+表达(76.04%±4.73%)明显高于常规培养的HT29细胞(分别为1.09±0.32、45.38%±10.65%),差异均有统计学意义(P0.05);HT29细胞微球的克隆形成率(66%±6%)明显高于常规培养的HT29细胞(18%±6%),差异有统计学意义(P0.01),表明结肠癌干细胞富集率达70%左右。结论悬浮培养法富集结肠癌干细胞操作简便、相对成本较低、便于掌握,培养基组成和传代次数是影响富集效果的关键。
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