hBPI与EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在MCF-7细胞中的表达和定位

目的：探讨人细菌透性增加蛋白（hBPI）在哺乳细胞中的表达和亚细胞定位。方法：以本人克隆得到的质粒pBE1为模板，利用一对带有Kozak序列以及删除终止密码子的引物进行PCR，获得的产物与pEGFP-N1载体连接，构建pBE2哺乳细胞特异表达载体并稳定转染MCF-7细胞，获得了转基因细胞系。提取其基因组DNA，PCR扩增检查BPIcDNA片段和EGFP片段是否已整合入MCF-7细胞基因组中。提取总RNA，通过RT—PCR方法检查BPI-EGFP在转录水平的表达。Western blot进一步鉴定融合蛋白的表达定位。结果：荧光显微镜观察显示，BPI—EGFP融合蛋白分布在整个细胞质中，并且在核膜周围有高表达。PCR扩增证实了BPIcDNA片段和EGFP片段已整合人MCF-7细胞基因组中。RT—PCR证明了hBPI和EGFP的融合蛋白在MCF-7细胞中在转录水平的表达。Western blot分析显示hBPI-EGFP以定位于细胞质和分泌到MCF-7细胞外两种形式表达。结论：hBPI-EGFP融合蛋白与天然的嗜中性的多核粒细胞中的定位和转运特点是一致的。