cDNA微矩技术用于脓毒症小鼠肺组织中差异性表达基因的检测

目的本文在小鼠盲肠结扎一穿孔引起的混合感染性脓毒症模型上,首次采用了cDNA微矩阵(基因芯片)检测技术,研究脓毒症中肺组织在脓毒症后早期(6h)和晚期(12h)的基因表达的改变,以期从基因水平上揭示脓毒症性急性肺损伤的发病机制并为进一步寻找其新的防治手段打下基础.方法(1)小鼠混合感染性脓毒症的构建以小鼠CLP,构建混合感染性脓毒症模型.(2)CLP后肺组织中差异性表达基因的检测小鼠分为脓毒症组(A组)及假手术对照组(B组)分别于CLP后6h、12h摘取全肺,-70℃保存待测;检测采用上海联合基因公司提供的含2304个小鼠cDNA克隆杂交点的MCEG20S型基因芯片;各组不同时点的肺组织标本经RNA提取、mRNA纯化后,经逆转录反应分别合成标记以Cy5(A组)或Cy3(B组)荧光素的cDNA探针;各时点的A、B两组探针混合后分别与上述基因芯片杂交,经严格洗脱后用ScanArray5000型激光共聚焦扫描仪以两种不同波长分别对芯片进行扫描,得到芯片的荧光信号强度数据;以Image3.0软件分析各时点两组间的荧光值之比(R).R＞2.0为表达上调,R＜0.5为表达下调.结果(1)CLP后小鼠肺组织均出现典型的急性肺损伤的病理改变.24h生存率为40%;48h的生存率为7.5%;72h的生存率为5%.(2)在CLP后6h和12h,共筛选出80个与假手术对照组相比出现差异性表达的已知功能基因,其中表达上调和下调者各40个;CLP后6h有23个已知基因出现差异性表达,其中上调者12个,下调者11个;CLP后12h,有75个已知基因出现差异性表达,其中表达上调者39个,下调者36个;(3)对以上差异性表达基因按其功能予以聚类分析,发现脓毒症引起的急性肺损伤涉及到肺组织中一系列功能基因的表达改变,其中包括免疫相关基因、急时相反应与热休克反应相关基因、抗氧化反应基因、细胞骨架相关基因以及多种细胞代谢和信息传递相关基因.它们对脓毒症的病理生理的演变,可能起了重要的作用.(4)通过对本试验所发现的差异性表达的基因的生物信息学分析,遴选出了具有进一步研究价值或潜在治疗作用的基因.结论脓毒症中,一系列与炎性反应和细胞免疫相关的基因表达增高.同时热休克反应、抗氧化反应以及与细胞能量代谢和骨架结构相关的基因表达抑制,这可能是脓毒症病理生理改变进行性加重的原因.利用基因芯片技术可高效率、大规模地检测脓毒症、AL和MODS时基因表达的改变,高通量筛选与脓毒症发生和发展相关的基因,有利于从分子水平上澄清脓毒症的病理生理机制,比较不同的干预治疗效果,寻找新的治疗目标和治疗药物.