AMPKα2基因克隆及其野生型和突变型真核表达载体的构建

背景：实验表明，通过激活单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-Activated Protein Kinase， AMPK) α2可以增加胰岛素的敏感性和骨骼肌葡萄糖的摄取，其有望成为预防和治疗2 型糖尿病的新的生理和药理作用靶点。 目的：克隆人的AMPKα2 基因，并构建其野生型和突变型真核表达载体。 设计：单一样本观察。 时间及地点：实验于2007-04/2008-01在中山大学附属第二医院临床分子生物实验室完成。 材料：QuikChange Ⅱ Site-Directed Mutagenesis Kit 为Stratagene公司产品。真核表达载体pcDNA3.1(+)，大肠杆菌DH5α为实验室保存。人骨胳肌组织来源于中山大学附属第二医院手术截肢患者，获患者知情同意，新鲜取材后液氮冷冻。 方法: 采用反转录-聚合酶链反应技术从人骨骼肌扩增AMPKα2基因，并将其克隆到T载体，通过测序对其进行鉴定。采用Quickchange定点诱变试剂盒对AMPKα2基因进行体外定点诱变，并将其野生和突变的编码基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1 中，通过酶切和测序进行鉴定。 主要观察指标：①目的基因的克隆。②定点诱变。③真核表达质粒的构建。 结果: 成功克隆了AMPKα2 基因，大小约1 700 bp，与已发表的AMPKα2同源性为99%，GenBank录入号EF056019。成功将AMPKα2第45位Lysine(AAA)突变为Arginine(AGA)，成功构建了野生型和突变型pcDNA- AMPK α2 重组质粒。 结论: 实验成功克隆了AMPKα2基因，构建了其野生型和突变型真核表达载体。

Cloning of activating adenosine monophosphate-activated protein kinase alpha 2 subunit gene and construction of its wild-type and mutant eukaryotic expression vectors