温胆汤通过调控PI3K/Akt/mTOR通路介导的脂肪细胞自噬对肥胖痰湿证炎症状态的影响

目的 观察温胆汤对肥胖痰湿证大鼠脂肪细胞炎症因子、自噬活性标志物及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）信号通路关键分子蛋白表达的影响，探讨肥胖痰湿证炎症状态形成的物质基础及温胆汤的干预机制。方法 将126只SD大鼠随机分成2组，即空白组16只和造模组110只，空白组喂养基础饲料，造模组喂养高脂饲料建立肥胖痰湿证动物模型，共8周。造模成功后，视体质量情况，按顺序淘汰体质量过轻者，遴选出48只肥胖大鼠，随机分为模型组、奥利司他组（32.40 mg·kg^-1）、雷帕霉素组（2 mg·kg^-1）、温胆汤低、中、高剂量组（4.45、8.90、17.80 g·kg^-1），每组8只；另在空白组大鼠中随机选取8只设为正常组，各用药组按剂量（以生药量计算）给予灌胃，模型和正常组给予等体积蒸馏水灌胃，每天1次，共6周。检测或计算大鼠体质量、Lee''s指数、脂体比和肥胖率，采用免疫组化二步法检测脂肪细胞自噬活性标志物动物自噬启动蛋白1（ULK1）、自噬效应蛋白1（Beclin1）、人自噬相关蛋白5（Atg5）、p62、微管相关蛋白1轻链3（LC3）Ⅰ/Ⅱ表达水平；采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测脂肪细胞炎症因子肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6、IL-1β、单核细胞趋化因子-1（MCP-1）、IL-4、IL-10、IL-13和转化生长因子（TGF）-β的表达；采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测脂肪细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路关键分子classⅠ-PI3K、磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3）、Akt、mTORC1、ULK1、结节性硬化症（TSC）1、TSC2的表达。结果 与空白组比较，造模组体质量和Lee''s指数显著升高（P<0.01），肥胖率>20%，有形体肥胖、活动度下降，食欲下降，皮毛无光泽、蓬松，便溏，对外界反应能力下降，饮水量减少等痰湿证表现，与正常组比较，模型组体质量、Lee''s指数、脂体比、脂肪细胞自噬活性标志物蛋白表达、促炎和抗炎细胞因子水平均明显升高（P<0.05，P<0.01），脂肪细胞classⅠ-PI3K、PIP3、Akt、mTORC1、TSC1、TSC2蛋白表达显著下降（P<0.01），但ULK1表达显著升高（P<0.01）。与模型组比较，各用药组体质量、脂体比、脂肪细胞自噬活性标志物蛋白表达、TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1、IL-4、IL-13水平明显降低（P<0.05，P<0.01），且雷帕霉素组、温胆汤中、高剂量组IL-10、TGF-β水平显著降低（P<0.01），奥利司他组TGF-β的表达显著降低（P<0.01），信号通路关键分子蛋白表达明显升高（P<0.05，P<0.01），但ULK1显著降低（P<0.01）。与雷帕霉素组比较，温胆汤各剂量组脂肪细胞所有自噬活性标志物蛋白表达显著升高（P<0.01），温胆汤低剂量组炎性因子（除TNF-α外）含量明显升高（P<0.05，P<0.01），信号通路关键分子蛋白表达明显降低（P<0.05，P<0.01），温胆汤中剂量组炎性因子（除IL-16、MCP-1、IL-10外）含量明显升高（P<0.05，P<0.01），温胆汤中、高剂量组信号通路各关键分子蛋白除PI3K外表达明显降低（P<0.05，P<0.01）。与奥利司他组比较，温胆汤低、中剂量组脂肪细胞自噬活性标志物蛋白表达显著升高（P<0.01），温胆汤低剂量组IL-6、IL-4、TGF-β含量显著升高（P<0.01），所有信号通路关键分子蛋白表达显著降低（P<0.01），温胆汤中剂量组IL-4含量显著升高（P<0.01），信号通路关键分子蛋白除PI3K外表达均明显降低（P<0.05，P<0.01），温胆汤高剂量组体质量、自噬活性标志物ULK1、LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表达水平明显升高（P<0.05，P<0.01），信号通路关键分子PIP3、mTORC1、TSC1蛋白表达明显降低（P<0.05，P<0.01），而自噬活性标志物Beclin1、Atg5蛋白、炎性因子TNF-α、IL-13含量明显降低（P<0.05，P<0.01）。结论 肥胖痰湿证炎症状态的形成与PI3K/Akt/mTOR通路介导的脂肪细胞自噬密切关联，且温胆汤可有效干预肥胖痰湿证大鼠的慢性炎症状态，其作用机制可能与调控该信号通路进而改善脂肪细胞自噬有关。