ACT1-qPCR定量分析弓形虫内参引物的筛选与鉴定

目的运用PCR对刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH、PRU、VEG株速殖子和HFF、Vero细胞系以及SPF级昆明鼠脑组织所得DNA样品进行特异性扩增,鉴定并筛选出适合用作弓形虫实时荧光定量PCR(q PCR)分析的内参引物。方法体外培养并无菌收集HFF、Vero细胞系及弓形虫RH、PRU、VEG株速殖子,SPF级昆明鼠经颈椎脱臼处死无菌采集脑组织,并提取基因组DNA。合成弓形虫MIC6基因(Toxo DB:TGME49_218520)特异性引物P1/P2,经PCR扩增鉴定所得样品是否含有弓形虫DNA成分,设空白对照。依照Toxo DB数据库弓形虫ACT1基因参考序列(Toxo DB:TGME49_209030)设计引物,经NCBI Primer-BLAST比对分析后进行合成特异性引物P3/P4、P5/P6、P7/P8、P9/P10和P11/P12,预期片段大小均为121 bp。以弓形虫RH DNA为模板,采用梯度PCR优化ACT1基因内参引物的退火温度。运用已优化条件对待检DNA样品进行PCR特异性扩增和琼脂糖凝胶电泳分析,鉴定出适合用于弓形虫q PCR定量分析的内参引物。结果 PCR扩增弓形虫RH、PRU和VEG株DNA MIC6基因时均出现一条长度约为1 050 bp的条带,且空白对照和其他样品无此条带,与预期结果一致,表明所得DNA样品可用。优化退火温度时发现,除P7/P8外其他引物均不受退火温度影响,56℃适合用于PCR或q PCR扩增ACT1基因目的片段的退火温度。以56℃为退火温度对待检DNA进行检测时发现,扩增弓形虫阳性样品时所有引物均能产生1条大小约为121 bp的条带,空白对照无此条带,与预期结果一致。此外,引物P7/P8、P9/P10扩增Vero细胞系和引物P3/P4、P5/P6、P9/P10扩增昆明鼠脑组织DNA样品时均有杂带出现,且有杂带大小约为121 bp;引物P11/P12扩增弓形虫阴性DNA样品时均无杂带出现。结论引物P11(5′-TCGGTGACGAAGCCCAAA-3′)和P12(5′-AGTTCGTTGTAGAAGGTGTGA-3′)适合分别用作弓形虫q PCR定量分析时扩增ACT1靶基因的上游和下游引物。