人瘢痕疙瘩成纤维细胞相关基因表达及青蒿琥酯的作用

目的 验证瘢痕疙瘩Fb中是否存在钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(CASK)和分化抑制因子1(ID1)的异常表达,观察青蒿琥酯对二者的影响. 方法 收集笔者单位患者手术后废弃的瘢痕疙瘩样本15个和正常皮肤组织样本12个,采用组织微粒贴壁法行Fb原代培养,取第3～8代细胞用于实验.免疫荧光染色观察2种Fb中CASK和ID1的表达,瘢痕疙瘩Fb用不同浓度青蒿琥酯作用不同时间,通过噻唑蓝比色法确定药物的半数抑制浓度(IC50)并作为后续实验药物干预浓度.选取正常皮肤Fb设为正常对照组(添加培养液处理),收集瘢痕疙瘩Fb分为瘢痕对照组(添加培养液处理)及瘢痕给药组(添加含IC50青蒿琥酯的培养液处理),流式细胞术检测各组Fb细胞周期和凋亡的变化,RT-PCR、蛋白质印迹法检测各组Fb中CASK和ID1的基因与蛋白表达情况.对数据行单因素方差分析及LSD-t检验. 结果 瘢痕疙瘩和正常皮肤Fb中均存在CASK和ID1表达,选择75 mg/L青蒿琥酯为后续实验干预浓度.(1)G0/G1期和G2/M期的细胞百分比3组之间比较,差异有统计学意义(F值分别为118.064、163.840,P值均小于0.01).其中瘢痕给药组G0/G1期为(91.4±1.4)％,明显高于瘢痕对照组的(80.7±0.3)％和正常对照组的(82.4±0.6)％(t值分别为12.740、9.872,P值均小于0.05)；G2/M期为(6.9±0.3)％,明显低于瘢痕对照组的(13.7±0.3)％和正常对照组的(12.7±0.8)％(t值分别为43.702、12.276,P值均小于0.05).(2)早晚期细胞凋亡率3组之间比较,差异均有统计学意义(F值分别为61.879、4710.862,P值均小于0.01).其中瘢痕给药组早期凋亡率为(7.1±1.0)％,明显高于瘢痕对照组的(2.6±0.4)％和正常对照组的(2.7±0.3)％(t值分别为7.974、7.767,P值均小于0.05)；晚期凋亡率为(14.9±0.3)％,明显高于瘢痕对照组的(2.3±0.3)％和正常对照组的(2.5±0.4)％(t值分别为72.882、69.792,P值均小于0.05).(3)瘢痕对照组CASK基因表达量为0.658±0.024,低于正常对照组的1.076±0.008(t =28.997,P＜0.01)；瘢痕给药组的基因表达量为0.855±0.008,较瘢痕对照组上升(t=13.549,P＜0.01).瘢痕对照组CASK蛋白表达量为0.067±0.007,低于正常对照组的0.179±0.015(t=12.042,P＜0.01)；瘢痕给药组为0.132±0.010,较瘢痕对照组上升(t=9.498,P＜0.01).(4)瘢痕对照组ID1基因表达量为0.416±0.006,高于正常对照组的0.317±0.020(t=8.299,P＜0.01)；瘢痕给药组为0.217±0.009,较瘢痕对照组下降(t=32.417,P＜0.01).瘢痕对照组ID1蛋白的表达量为0.789±0.034,高于正常对照组的0.366±0.029(t=16.341,P＜0.01)；瘢痕给药组为0.114±0.006,较瘢痕对照组下降(t=33.978,P＜0.01). 结论 推测CASK和ID1参与了瘢痕疙瘩Fb的增殖过程,青蒿琥酯抑制瘢痕疙瘩Fb增殖的机制可能与上调CASK和下调ID1表达有关.

Expressions of the related genes in fibroblasts of human keloid and the effect of artesunate