低氧及其下游因子miRNA-145在脐带间充质干细胞向Ⅱ型肺泡上皮细胞分化中的作用

目的：探讨低氧和转化生长因子β（TGF-β）对脐带间充质干细胞（UCMSC）向Ⅱ型肺上皮细胞（ATⅡ）分化的影响以及微小RNA-145（miR-145）在此过程中的调控作用，阐明UCMSC在损伤肺组织微环境中低氧和TGF-β的双重刺激下向ATⅡ分化的机制。方法：体外分离人UCMSC，与人肺癌细胞株A549共培养，诱导UCMSC向ATⅡ分化。采用氯化钴在体外模拟低氧环境，将细胞分为常氧诱导组和低氧诱导组，应用相差显微镜观察低氧诱导组细胞的形态变化，应用流式细胞术检测诱导细胞中ATⅡ所占百分比；在常氧诱导组和低氧诱导组中，采用定量PCR（qPCR）和Western blotting法分别检测ATⅡ特异性基因、细胞纤维化相关基因和miR-145表达水平。在低氧诱导组中，将细胞分为miR-145抑制剂组、miR-145抑制剂对照组和miR-145未抑制组，应用qPCR和Western blotting法检测诱导后3组细胞中纤维化相关基因的表达水平。在293T细胞中分别转入miR-145前体（pre-145）和miR-145前体对照（pre-145 scramble），应用双荧光素酶报告基因系统检测TGF-βRⅡ 3'-UTR野生型及突变型的相对荧光素酶活性（RLU）。结果：低氧诱导组中UCMSC由最初的成纤维样细胞逐渐变为扁平梭形，培养8 d后呈铺路石样上皮细胞形态，并且高表达ATⅡ表面分子标志SpC的诱导细胞所占百分率达到（94.50±3.37）%。与常氧诱导组比较，低氧诱导下ATⅡ特异性基因KGF、CK18、SpA、SpB和SpC以及miR-145表达水平明显升高（P<0.05）。在UCMSC-ATⅡ分化过程中加入TGF-β1刺激后，与常氧诱导组比较，低氧诱导组中细胞纤维化相关基因Col-Ⅰ、TGF-βRⅡ及TGFβRⅡ下游信号因子p-Smad2和p-Smad3表达水平明显下降（P<0.05）。在低氧诱导条件下，与miR-145抑制剂对照组和miR-145未抑制组比较，miR-145抑制剂组中Col-Ⅰ和TGF-βRⅡ表达水平明显升高（P<0.05）。与TGF-βRⅡ 3'-UTR突变型比较，miR-145前体作用下TGF-βRⅡ 3'-UTR野生型的RLU降低（P<0.05）。结论：低氧能够促进UCMSC向ATⅡ分化并抑制TGF-β1引起的纤维化，其机制可能是低氧通过上调miR-145直接抑制TGF-βRⅡ表达从而阻断TGF-β1/TGF-βRⅡ信号通路。