培美曲塞与吉非替尼联合应用对肺腺癌细胞放射增敏的基础研究

目的：观察培美曲塞二钠与EGFR抑制剂吉非替尼单独及联合使用对肺癌细胞放射增敏作用，探讨其作用机制。方法：1、使用噻唑蓝比色法(MTT)，检测培美曲塞二钠和EGFR抑制剂吉非替尼各自对人肺腺癌细胞株A549细胞的抑制作用，分别计算出两种药物的IC20和IC50，接着参照各自IC20的药物浓度及预实验结果确定作为放射增敏的浓度。2、采用体外培养克隆形成实验，检测培美曲塞二钠和EGFR抑制剂吉非替尼联合放射线对人肺腺癌细胞株A549细胞的抑制作用，计算其存活分数，同时绘制细胞存活曲线。3、使用流式细胞术，检测细胞周期和细胞凋亡的变化。4、提取蛋白，使用Western-blot，检测Akt和pAkt的表达变化，进一步探索两药联合及放射增敏效应的可能作用机制及细胞信号通路。结果：1．MTT结果显示培美曲塞二钠和吉非替尼对人肺腺癌细胞株A549细胞具有抑制增殖作用，随剂量增加而增强。培美曲塞二钠的IC50为(1485.326) ng/ml；吉非替尼的IC50为(7.196) uM。2．体外培养克隆形成实验分析显示，放疗+两药联用组的Dq、D0及SF2均明显低于单纯放疗组、放疗+培美曲塞二钠组及放疗+吉非替尼组；培美曲塞二钠和吉非替尼SER分别为1.17和1.48，两药联合 SER为2.62。两药联用的放射增敏效应明显高于各自单药的放射增敏效应，两药联合使用可以进一步提高放射增敏作用。3．流式细胞术检测细胞周期结果显示培美曲塞二钠和吉非替尼可以使细胞阻滞在G1/G0期；与放射线联合作用后，使S期细胞比例减少，两药合用作用更明显。检测凋亡结果显示培美曲塞二钠和吉非替尼均可以提高放射线诱导的凋亡，但两药联用可以使其凋亡率达到最高，提示两药联合作用可以进一步提高放射线诱导的细胞凋亡。4．Western- blot结果显示，药物作用前后、照射前后及药物增敏照射后Akt在蛋白表达水平没有明显改变；培美曲塞二钠和吉非替尼均能抑制p-Akt的表达；与单纯照射组相比，培美曲塞二钠和吉非替尼联合照射组p-Akt蛋白的表达减低，两药联用并联合照射组p-Akt/Akt的比值最低。结论：培美曲塞二钠和吉非替尼各自均有放射增敏的作用，两药联合使用可以明显提高放射效应。其机制可能涉及到使细胞周期中对放射线不敏感的S期细胞减少到最低，同时进一步增强了放射线诱导的细胞凋亡；另外可以推断培美曲塞二钠和吉非替尼两药都可抑制PI3K/Akt信号转导通路，为两药联合应用进一步提高放射增敏效应的可能的机制之一。

Research the radiosensitization on human lung adenocarcinoma A549 cells with pemetrexed disodium and EGFR inhibitors