粉尘螨Ⅱ类抗原cDNA原核表达质粒的构建与表达

目的构建粉尘螨Ⅱ类抗原cDNA基因的重组表达质粒，并在大肠埃希菌中表达。方法采用亚克隆技术，用Sac Ⅰ和Not Ⅰ从重组质粒pMD-18T-Der f2上切下Der f2 cDNA片段，插入表达载体pET-32a( )质粒，转化大肠埃希菌BL21，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性重组子，并经双酶切及PCR扩增鉴定。重组质粒pET-32a( )-Der f2转化大肠埃希菌，IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳和薄层凝胶扫描定量分析。结果对重组质粒进行酶切和PCR鉴定，获得455bp大小的目的基因片段，与预期结果相符，证明已成功构建携带Der f2基因的重组原核表达质粒pET-32a( )-Der f2。核酸序列测定及同源性分析证实，所构建的原核表达质粒pET-32a( )-Der f2中所含的Der f2 cDNA片段与GenBank中的Der f2序列同源性达到100％。Der f2 cDNA在大肠埃希菌诱导表达后获得分子质量单位为34ku的蛋白，蛋白含量占菌体蛋白含量的16％。结论成功构建了粉尘螨Ⅱ类抗原cDNA基因的重组表达质粒pET-32a( )-Der f2，并在大肠埃希菌中获得高效表达，为获得重组纯化Der f2变应原并用于尘螨变应性疾病的诊治奠定基础。