应用TT法测定家兔尿液中重组水蛭素浓度的方法学研究

目的:建立一种生物测定法——凝血酶时间法(TT 法),以测定家兔尿液中的重组水蛭素(rH),进而研究其尿药排泄动力学。方法:依据 rH 的抗凝血酶活性,采用 TT 法测定家兔尿中的 rH 浓度。取家兔尿液10μL,依次加入空白血浆40 μL、pH 7.4的 Tris-HCl 缓冲液50μL,以及5 u·mL~(-1)的凝血酶溶液50μL,由血凝仪记录凝血时间并计算凝血时间延长百分率,从标准曲线求出待测尿液中的 rH 浓度。结果:TT 延长百分率(Y)经对数转换与尿液中 rH 浓度(X,μg·mL~(-1))呈线性相关,线性方程为 Y=0.7598X 1.0098,r=0.9956,线性范围0.49～2.50μg·mL~(-1),最低检测限为0.49μg·mL~(-1)。高、中、低3种浓度 rH 尿液标准溶液测得的日内精密度 RSD 小于8.10%,日间精密度 RSD 小于9.07%,回收率为95.6%～97.7%,稀释回收率大于95.6%(5～200倍稀释)和91.9%(500倍稀释)。水蛭素尿液标准溶液冰冻(-20℃)保存至少半月内稳定,0～4℃及室温保存至少8 h 内稳定,-20℃及室温反复冻融3次稳定。3只家兔 iv rH 1.0 mg·kg~(-1)后不同时间段收集尿液,应用 TT 法测定其 rH 浓度,经亏量法求得 rH 的消除半衰期为65.4 min,其 log(X_(u∞)-X_(ut))-t 作图符合尿药排泄动力学曲线。结论:应用 TT 法测定家兔尿中的rH 浓度,方法特异性高、精密度好、回收率高、线性好,结果准确可靠,可用于家兔尿中 rH 浓度的测定和尿药排泄动力学的研究。

Determination of r -hirudin in urine of rabbits by thrombin time method