逆转录病毒载体介导人胰岛素样生长因子Ⅰ在大鼠成肌细胞中的表达及分泌

目的:将经逆转录病毒载体的介导的人胰岛素样生长因子Ⅰ基因导入大鼠成肌细胞,观察其是否表达,为组织工程人工肌肉体内基因治疗打下基础。方法:实验于2005-10/2006-12在华中科技大学同济医学院协和医院心血管病研究所完成。①实验材料:PLghIGF1SN由本实验室保存,逆转录病毒包装细胞系GP E86购自Clontech公司,包装细胞PT67购自ATCC。②实验方法:选用新生SD乳鼠骨骼肌进行成肌细胞的原代培养,选用新生SD乳鼠心脏进行心肌细胞的培养。通过脂质体2000将人胰岛素样生长因子ⅠcDNA导入逆转录病毒包装细胞PT67,经过G418筛选获取稳定表达病毒的克隆,NIH3T3细胞测定病毒滴度,挑取滴度高的克隆扩增,收取高滴度的病毒上清液,转染成肌细胞。③实验评估:G418筛选转染过的成肌细胞,采用ELISA方法检测其上清液中人胰岛素样生长因子Ⅰ的表达,采用MTT法检测人胰岛素样生长因子Ⅰ的生物学活性。结果:①病毒滴度的测定:利用不同量的病毒上清感染1×105NIH3T3细胞,并经G418筛选,测得不同PT67克隆的培养上清中,病毒滴度最高为8×105cfu/mL。②ELISA方法检测人胰岛素样生长因子Ⅰ的表达:在转染后大鼠成肌细胞分泌的上清液中可以检测到人胰岛素样生长因子Ⅰ的表达,经过G418筛选2周后,收集培养液,人胰岛素样生长因子Ⅰ浓度最高在40μg/L,总量可以达到(150～200)ng/2×106/d。未转染成肌细胞组人胰岛素样生长因子Ⅰ浓度约在0.3μg/L。③MTT法检测人胰岛素样生长因子Ⅰ的生物学活性:转染的成肌细胞培养上清液刺激心肌细胞后,心肌细胞活力明显增加。结论:人胰岛素样生长因子Ⅰ基因可在鼠成肌细胞内稳定表达并具有生物学效应,可用于心血管系统基因治疗的研究。

Expression and secretion of human insulin-like growth factor Ⅰ mediated by a retroviral vector in rat myoblasts