增强型绿色荧光蛋白标记技术示踪组织工程化骨形成

目的:观察以脂质体介导法转染的增强型绿色荧光蛋白质粒作为骨组织工程种子细胞示踪剂的可行性。方法:实验于2005-07/2006-11在南昌大学第二附属医院分子医学实验室完成。选取12个月龄中国青山羊2只作为骨髓基质干细胞供体。另取BACB/un裸鼠9只作为骨髓基质干细胞-珊瑚复合物受体。①将已转化pEGFP-N2大肠杆菌109菌种,进行质粒提取并经AvaⅡ酶切鉴定。②脂质体lipofectamine2000介导转染羊骨髓基质干细胞。分别于转染24h、6个月后计算荧光的转染效率。标记与未标记细胞经成骨诱导分化后,检测碱性磷酸酶活性和四环素钙结节染色,以未标记的同期细胞作对照。③将标记细胞接种于珊瑚支架,形成骨髓基质干细胞-珊瑚复合物,分别于体外培养4,7,14d后进行电镜扫描观察。④将体外培养7d的骨髓基质干细胞-珊瑚复合物移植于裸鼠皮下,8周后取出,荧光显微镜下进行示踪观察,苏木精-伊红染色观察组织结构。以未标记的骨髓基质干细胞-珊瑚复合物、单纯珊瑚作对照。结果:共纳入中国青山羊2只,BACB/un裸鼠9只,作为受体的9只裸鼠进入结果分析。①质粒经酶切后电泳,可见3条带,分别为445bp,1938bp,2354bp,确定所提质粒为pEGFP-N2。②转染24h后绿色荧光表达率35%;经G418筛选,转染6个月后绿色荧光表达率75%;与对照组相比,标记细胞碱性磷酸酶活性差异无统计学意义(P>0.05),均具有钙结节形成能力。③标记细胞与材料贴附生长良好,并分泌胶原纤维及钙盐结晶样基质。④组织学示新生骨样组织围绕材料孔隙生成;新生组织细胞内有绿色荧光表达,同时对照组未观察到绿色荧光。结论:脂质体介导法转染的pEGFP-N2标记骨髓基质干细胞,可用于裸鼠体内示踪,是一种理想的组织工程化骨组织的示踪方法。

Enhanced green fluorescent protein labeling technology in monitoring the formation of tissue-engineered bone