复苏促进因子结合蛋白A的原核表达及对耻垢分枝杆菌的促生长作用

目的在大肠埃希氏菌中表达结核分枝杆菌复苏促进因子结合蛋白A蛋白(RipA),纯化后观察该蛋白对耻垢分枝杆菌的促生长作用。方法采用PCR方法 ,从结核分枝杆菌H37Rv的DNA中扩增出编码RipA蛋白的Rv1477基因,测序正确后克隆入原核表达载体pProEx HTa,构建重组表达质粒pProEx HTa-RipA。以重组质粒转化大肠杆菌DH5a,筛选阳性重组菌株,经异丙基硫代-β-D半乳糖苷诱导RipA表达,在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化。将纯化的RipA蛋白加入到耻垢分枝杆菌中,观察RipA蛋白的促生长作用。结果成功扩增了Rv1477基因,并克隆于表达载体pProEx HTa中,经酶切鉴定获得阳性克隆,经诱导,在大肠杆菌中表达出相对分子质量为52×103的目的蛋白,Western-blot结果显示该蛋白与6×HisAb有特异性的反应条带。采用Ni+-NTA柱可获得纯化的目的蛋白。100pM的RipA蛋白可显著促进耻垢分枝杆菌休眠菌的复苏和生长。结论 RipA蛋白在大肠杆菌中成功表达,并能有效促进耻垢分枝杆菌的生长,为MTB的快速诊断研究奠定了基础。