建立永生化骨髓间充质干细胞株

目的:将外源性人端粒酶反转录酶基因转入人骨髓间充质干细胞,以建立永生化细胞株。方法:实验于2006-01/2007-01在石河子大学新疆地方与民族高发病省部共建教育部重点实验室完成。①实验材料:骨髓标本采自因意外事故引产死亡的8个月正常胎儿,家属均签署知情同意书。大肠杆菌DH5α分子克隆的受体菌由本室保存。质粒pBabepuro-hTERT由美国Weinberg博士惠赠。PA317细胞和Hela细胞由郭志儒博士惠赠。NIH3T3细胞由黄瑾博士惠赠。②实验方法:无菌条件下将骨块置于α-MEM培养液中,分离及扩增培养人骨髓间充质干细胞。提取并纯化质粒pBabepuro-hTERT,转染包装骨髓间充质干细胞,经嘌呤霉素筛选后获得抗性克隆,选取病毒滴度最高的细胞克隆感染生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞。③实验评估:采用端粒酶重复序列扩增法-酶链免疫吸附法检测人骨髓间充质干细胞转染前后端粒酶活性的变化,样本的△A值高于0.2视为端粒酶阳性。结果:①骨髓间充质干细胞的形态观察:第3代人骨髓间充质干细胞形态不规则,体积较大的细胞逐渐死亡,以梭形为主。②基因转染包装细胞和克隆筛选结果:嘌呤霉素筛选7d后,转染的细胞出现抗性克隆。待细胞克隆长至肉眼可见时将细胞克隆消化后扩增培养,挑选出4个抗性克隆,分别命名为克隆1,2,3,4。③病毒滴度的测定:1～4号细胞克隆的病毒滴度分别为3×106,7×105,4×105,9×106cfu/L。④端粒酶活性变化的检测:未转染的第3代骨髓间充质干细胞△A值为0.121±0.043,端粒酶活性为阴性。第3代人端粒酶反转录酶-骨髓间充质干细胞的△A值为1.741±0.103,端粒酶活性为阳性。结论:导入外源性人端粒酶反转录酶基因后可激活骨髓间充质干细胞的端粒酶活性。

Construction of immortalized human bone mesenchymal stem cell strain