| 摘 要： | 目的构建过表达白细胞介素(IL)-35的慢病毒载体,包装慢病毒并感染肺癌细胞A549建立过表达IL-35的A549稳定细胞株,为研究IL-35在肺癌发生发展中的作用奠定基础。方法根据基因序列及所用载体序列设计用于无缝克隆的引物序列,用聚合酶链式反应(PCR)扩增IL-35基因,EcoRⅠ和Bam HⅠ酶切PCR产物及载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro,经载体重组、转化、PCR鉴定和测序鉴定等获得重组质粒。将筛选出的重组慢病毒质粒与包装质粒共转染HEK-293T细胞,收取病毒浓缩液并检测其滴度。病毒浓缩液感染A549细胞,用Real-time PCR和Western blot方法检测稳转细胞系中IL-35的表达。结果测序结果与预期完全符合,成功构建过表达载体IL-35-pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro。pCDH-GFP组及pCDH-IL-35-GFP组的慢病毒滴度分别为5.1×10~8和1.03×10~9TU·mL^(-1)。Western blot和real-time PCR显示,A549-IL35组的EBI3及P35蛋白相对表达量分别为0.27±0.05和0.75±0.02,A549-pGFP组的EBI3及P35蛋白相对表达量分别为0.06±0.01和0.24±0.01,A549-IL35组的EBI3及P35 mRNA的相对表达量分别为444.75±37.31和309.78±53.92,A549-pGFP组的EBI3及P35 mRNA相对表达量分别为1.03±0.05和1.04±0.03,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论成功构建了过表达IL-35的慢病毒载体和过表达IL-35的A549稳定细胞株。
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