成年兔关节软骨创伤模型中软骨细胞的分离及体外培养观察

目的观察成年兔关节软骨损伤模型中能获得的关节软骨和软骨细胞数量,探讨不同浓度的Ⅱ型胶原酶在不同时间段分离软骨细胞的能力及体外培养所获得的软骨细胞的生物学活性。方法建立成年兔关节软骨损伤模型,用0.1%~0.2%Ⅱ型胶原酶消化4小时,每小时收集消化下来的兔膝关节软骨细胞,计数细胞收获率和细胞存活率。体外培养原代及传代细胞,观察细胞形态和生长规律,绘制生长曲线,检测细胞合成Ⅰ、Ⅱ型胶原、蛋白多糖能力。结果成年兔膝关节软骨细胞的收获率平均为3603.6×104个/克,细胞存活率平均为97.3%,胶原酶浓度与细胞的获取率无显著关系,但与细胞的存活率相关,在消化时间超过3h后细胞的存活率显著降低,在培养过程中出现易老化现象,原代细胞贴壁时间为48~72h,甲苯胺蓝异染反应较强,Ⅱ型胶原免疫组化染色反应呈强阳性,Ⅰ型胶原免疫组化染色为阴性,传3代细胞形态由卵圆形、多角形变为梭形,甲苯胺蓝染色异染反应较弱,免疫组化Ⅰ型胶原为强阳性而Ⅱ型胶原表达极弱。结论0.1~0.2%Ⅱ型胶原酶消化、分批收取细胞具有较高的细胞收获率和存活率,体外培养时,从创伤后关节软骨中获得的原代细胞和1代细胞具有良好的软骨表型,第3代及以后的细胞生物学活性低下。

Isolation of Chondrocytes from the Adult Rabbit Model of Impacting Injury of Articular Cartil~e-and observation of Their Biological Characteristics during Cultivation in Vitro