人胚胎神经干细胞分离、培养、纯化及增殖潜能的特点

目的：探讨获取和培养人胚胎神经干细胞的方法。方法：实验于2003-09／2004—12在重庆医科大学基础研究所完成。人胚胎来源为7-12周人工药物流产胎儿，由重庆医科大学附属第二医院及重庆市妇幼保健院提供，征得产妇本人同意。①从人胚胎大脑皮质中分离、培养、纯化原代神经干细胞，经体外反复传代培养以获得能在体外长期生存的神经干细胞。②免疫细胞化学鉴定神经干细胞特异性表达抗原。⑧观察不同种植细胞密度对神经干细胞增殖的影响，分析其生长特点并绘制生长曲线。④采用悬浮细胞培养法扩增细胞，冷冻复苏后观察细胞的生物学特性。结果：①人胚胎神经干细胞体外生长特点：从7～12周流产胎儿大脑皮质中获得了能在体外长期生存的神经干细胞。经体外传至15代，神经干细胞细胞数量扩增至200倍。②神经干细胞接种密度对增生的影响：当种植细胞的密度为1&;#215;10^5L^-1,1&;#215;10^7L^-1时，体外培养30d后仍呈单细胞贴壁状态。以1&;#215;10^9L^-1细胞密度接种时，12h后即见多个单细胞聚成的小球，悬浮生长。③神经干细胞自我更新能力的检测结果：多数单个细胞在培养后24～48h分裂为2-4个细胞的小克隆，7～10d均发展为上百个细胞的较大的克隆。④nestin抗原的表达：培养的神经干细胞神经球nestin免疫细胞染色均呈阳性。⑤神经干细胞多向分化能力检测：NSE和GFAP免疫细胞化学染色显示，被测细胞胞浆有棕黄色颗粒沉着，呈阳性表达。⑥神经干细胞复苏后的存活率：冻存1，4，8，12周的神经干细胞存活率基本相似[（80．2&;#177;1．8）％，（80．1&;#177;1．2）％，（79．9&;#177;0．8）％，（80．1&;#177;2．1）％，P〉0．05]。结论：成功地从人胚胎大脑皮质中分离得到了神经干细胞。经体外培养证明：人胚胎神经干细胞具有自我更新增殖能力和向神经元样细胞、星形胶质样细胞分化的潜能。

Isolation, cultivation, purification and proliferative potential of human embryonic neural stem cells