靶向人血管紧张素原小干扰RNA表达质粒的构建和鉴定

背景：RNA干扰技术通过将具有一定结构特点、长19~25 bp的双链小干扰RNA导入哺乳动物细胞，特异性降解与其序列具有同源性的mRNA分子，导致目的基因表达抑制。 目的：拟构建针对人血管紧张素原mRNA的小干扰RNA表达载体，从而抑制肾素基因在脂肪细胞的表达。 方法：从NCBI中查找人血管紧张素原基因全长mRNA序列(NM000029)，利用GeneScript公司提供的在线小干扰RNA模板序列设计软件，自行设计靶向血管紧张素原的两条shRNA的DNA模板单链，合成靶向血管紧张素原基因转录可形成茎环结构的寡聚核苷酸，退火后与酶切后的psiRNAT-U6.1/Neo质粒连接，在TOP10菌株中扩增，并测序鉴定。 结果与结论：将含有血管紧张素原-mRNA目标序列19 bp的双链DNA插入片段，连接到pRNAT-U6.1/Neo质粒形成重组质粒。EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切后，空载体得到351 bp小片段，而人重组质粒得到397 bp小片段，与预期相符。EcoRⅠ和Kpn Ⅰ双酶切后，空载体得到1条345 bp小片段，而人重组载体没有得到小片段条带，与预期相符。测序结果表明psiRNAT-U6.1/Neo质粒已经插入人脂肪细胞的干扰合成片段，无碱基突变，成功构建了靶向血管紧张素原-小干扰RNA表达载体。

Construction and identification of small interfering RNA expression plasmid target to angiotensinogen