Pyk2/PI3K/NF-κB在心脏成纤维细胞表型转化及迁移中的作用

目的 用短发夹RNA干扰技术选择性下调大鼠心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)中富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(prolein-rich tyrosine kinase 2,Pyk2)的表达,检测Pyk2/PI3K/NF-κB在细胞表型转化及迁移的作用.方法 利用Pyk2特异短发夹RNA质粒载体,转染血管紧张素Ⅱ刺激的原代培养大鼠心脏成纤维细胞.使用Transwell小室模型、体外划痕法检测细胞迁移变化,并结合免疫荧光观察α-平滑肌肌动蛋白表达变化.蛋白印迹法检测Pyk2和磷酸化磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K) p85亚基的蛋白水平,EMSA检测核转录因子κB(NF-κB)活性.结果 Transwell实验显示CFs跨膜细胞数随培养时间延长而上升,但Pyk2 shRNA转染组在不同时相点跨膜细胞数较对照组均明显减少,在6 h分别为(19.1±6.1)和(30.8±8.6),P<0.05],在12 h分别为(37.7±12.4)和(53.6±11.3),P<0.05],而在24 h分别为(78.9±18.5)和(102.3±21.7),P<0.01].转染Pyk2 shRNA后α-平滑肌肌动蛋白表达明显受抑制,绿色阳性染色细胞的比例下降,荧光强度减弱.体外划痕法显示Pyk2 shRNA转染组细胞迁移距离明显下降,在24 h 分别为0.838 mm和1.213 mm(P<0.05),在48 h分别为1.626 mm和2.049 mm(P<0.01).Pyk2 shRNA转染组Pyk2和PI3K p85表达的相对条带强度较对照组减弱(0.47 vs 0.61,P<0.05),磷酸化PI3K p85表达水平也较对照组有明显降低(0.31 vs 0.42,P<0.05).NF-κB平均光密度分别为2.17和3.59(P<0.05).结论 Pyk2/PI3K/NF-κB可能是促进CFs向肌成纤维细胞表型转化和介导细胞迁移的重要信号途径,Pyk2可能成为防治心脏纤维化的新靶点.