垂体腺苷环化酶激活肽对原代培养海马神经元氧化损伤的保护作用

目的:在原代培养的大鼠海马神经元上观察不同浓度垂体腺苷环化酶激活肽-38对活性氧所致神经元氧化损伤的保护作用,为垂体腺苷环化酶激活肽-38的神经保护作用提供依据。方法:实验于2001-09/2002-03在解放军总医院老年医学研究所神经生物学研究室完成。取新生1～3d的SD大鼠海马进行神经元原代培养,将细胞随机分成5组:对照组,活性氧组,1×10-8mol/L,1×10-10mol/L和1×10-12mol/L垂体腺苷环化酶激活肽-38组。分别用次黄嘌呤(mmol/L)/黄嘌呤氧化酶(U/L)1.0/200,1.5/150,2.0/200,2.0/300,3.0/300处理细胞诱导氧化损伤模型,选择次黄嘌呤2.0mmol/L/黄嘌呤氧化酶200U/L作为最终的活性氧浓度,进一步观察垂体腺苷环化酶激活肽-38的神经保护作用。采用四甲基偶氮唑蓝比色法测定神经元存活率,光学显微镜下照像,利用计算机图像分析软件分析神经元的形态改变,应用荧光素JC-1染色-激光流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位,利用反转录-聚合酶链反应法半定量天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3的mRNA水平。结果:①细胞存活率分别为:对照组77.8%,次黄嘌呤1.0mmol/L/黄嘌呤氧化酶200U/L活性氧组62.5%,次黄嘌呤1.5mmol/L/黄嘌呤氧化酶150U/L活性氧组50.1%,次黄嘌呤2.0mmol/L/黄嘌呤氧化酶200U/L活性氧组48.4%,次黄嘌呤2.0mmol/L/黄嘌呤氧化酶300U/L活性氧组25.3%,次黄嘌呤3.0mmol/L/黄嘌呤氧化酶300U/L活性氧组28.9%。与对照组比较,神经元的存活率随着培养液中活性氧浓度的增加而呈显著下降趋势(P<0.01)。②活性氧不仅能引起培养神经元的存活率下降(P<0.01),还能导致神经元出现神经退行性变样的形态学损伤,包括细胞皱缩,突起脱落、突起数减少[对照组(2.6±0.6)个,活性氧组(0.5±0.2)个,P<0.01],多极神经元百分率下降(对照组为32.6%,活性氧组为10.1%,P<0.01),同时,也能引起神经细胞的线粒体膜电位显著下降(对照组为40,活性氧组为12.3,P<0.01)和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3mRNA水平增加(对照组为0.13%,活性氧组为3%,P<0.01)。③预先给予1×10-8mol/L,1×10-10mol/L和1×10-12mol/L的垂体腺苷环化酶激活肽-38能显著改善活性氧引起的神经退行性损伤和线粒体膜电位下降(P<0.05或P<0.01),抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3的表达(P<0.01),其中,1×10-8mol/L垂体腺苷环化酶激活肽-38的神经保护作用最强(P<0.01)。结论:活性氧可直接损伤培养的神经元,导致神经元出现形态学退行性改变和神经元存活率下降,形态学改变和死亡率增高与线粒体功能下降和神经细胞核内凋亡基因表达均有关。垂体腺苷环化酶激活肽-38具有明显的抗氧化损伤和神经保护作用,并且这种保护作用具有浓度依赖性。

Protective effect of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide on oxidative damage in the primary cultured hippocampal neurons