人白细胞介素12腺病毒载体构建及在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的：构建人白细胞介素12（Human interleukin-12, hIL-12）5型腺病毒载体（Ad hIL-12），感染人骨髓间充质干细胞（Human bone-marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs），检测IL-12的表达，为IL-12临床应用方式的改进奠定基础。 方法：实验于2009-05/2009-12在解放军北京军区总医院生物治疗中心实验室完成。人树突状细胞（Dendritic cells, DCs）经细菌脂多糖（LPS）处理24 h后提取DCs总RNA，用RT-PCR方法获得hIL-12 p35和p40基因cDNA，分别克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)和pmRNA IRES中；然后再亚克隆至腺病毒载体穿梭质粒pDC515，p35和p40 cDNA通过脑心肌炎病毒内部核酸进入位点（Internal ribosomal entry sites, IRES）连接，构建pDC515 hIL-12 p35/IRES/p40腺病毒穿梭质粒。采用Ad MaxTM腺病毒载体体系，pDC515 hIL-12 p35/IRES/p40穿梭质粒与pBHGfrtE1，3FLP骨架质粒共转染至293细胞，通过重组酶位点特异性重组获得Ad hIL-12。常规培养hBMSCs，第三代hBMSCs按每孔5105细胞接种至12孔板中，Ad hIL-12按每个细胞100 pfu的感染复数（MOI）感染hBMSCs 2 h后经10 Gy 射线照射使hBMSCs失去增殖能力，每24 h更换一次培养液，收集1-5天的细胞培养上清，用hIL-12p70 ELISA试剂盒检测细胞上清中hIL-12的含量。 结果：经测序证实，RT-PCR所获得的hIL-12 p35和p40基因cDNA序列与GenBank NM_000882（762 bp）和NM_002187（987 bp）提供的序列完全一致。pDC515 hIL-12 p35/IRES/p40穿梭质粒与pBHGfrt E1,3FLP骨架质粒共转染至293细胞约10天左右细胞开始有空斑（plagues）形成，挑取明显的空斑接种至293细胞，经过2-3轮扩增后，收集293细胞冻溶裂解，提取DNA进行PCR鉴定，分别获得hIL-12 p40和p35 PCR片段，证实冻溶裂解物中含有hIL-12 p40和p35基因DNA片段。纯化的病毒按100 pfu/细胞的MOIs感染hBMSCs，ELISA检测12 h即有IL-12的分泌，至24-48 h表达量到达高峰，并持续表达至第五天表达水平仍无下降趋势，12 h、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h hIL-12表达量分别为(4.91±0.09) 、(59.40±1.17) 、(106.88±1.64) 、(144.53±3.10)、(182.72±0.14)和(205.83±0.14) ng/106细胞/24 h。 结论：用Ad MaxTM腺病毒载体体系可高效、快捷地获得所要包装的腺病毒载体，通过IRES连接hIL-12的两个亚基p40和p35可有效地表达IL-12p70蛋白；Ad hIL-12腺病毒载体感染hBMSCs后可持续高水平分泌hIL-12，在以hBMSCs为载体细胞的基因治疗中有潜在的应用前景。

Construction of an adenoviral vector encoding human interleukin-12 and its expression on human mesenchymal stem cells