肺炎克雷伯菌CRP对kfuABC操纵子的转录调控机制研究

目的：利用分子生物学实验研究肺炎克雷伯菌环磷酸腺苷受体蛋白（cAMP receptor protein，CRP）对kfuABC操纵子的转录调控机制。方法：设计相关跨基因引物，用Real-time PCR方法验证kfuABC的转录结构。以肺炎克雷伯菌野生株NTUH-K2044（wild type，WT）的总RNA为模板，利用引物延伸的方法寻找kfuA的转录起始位点，确定其核心启动子区。构建含kfuA启动子区DNA序列的LacZ重组质粒，并将其转入突变株?驻crp（肺炎克雷伯菌野生株基因组中crp基因敲除）和WT中，通过测定比较两株菌中β-半乳糖苷酶活性差异来判定CRP调控子对kfuA的调控关系；分别提取?驻crp和WT的总RNA，进一步采用实时定量Real-time PCR的方法验证CRP对kfuA的调控关系。通过凝胶阻滞实验验证His-CRP是否对kfuA启动子区具有直接的结合作用，进一步采用 DNaseⅠ足迹实验确定具体的结合位点。结果：肺炎克雷伯菌kfuA、kfuB和kfuC位于同一个操纵子kfuABC；引物延伸实验结果显示kfuABC只有一个转录起始位点T；CRP能够结合到kfuABC启动子区-204到-171之间的碱基序列上（转录起始位点为+1），抑制其转录表达。结论：CRP能直接结合到kfuABC启动子区抑制其转录表达。