核因子I-B高表达对肝L02细胞中蛋白磷酸酶2A-B55δ靶向调控研究

目的 构建核因子I-B基因(NFIB)真核表达重组质粒,应用于其高表达调控肝细胞中蛋白磷酸酶2A(PP2A)的B亚基基因转录的功能学验证.方法 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得人NFIB mRNA片段,克隆入真核绿色荧光蛋白表达载体(pEGFP-N1),构建pEGFP-NFIB重组质粒后,分别给予250、500、1 000 ng转染永生化人正常肝L02细胞建立NFIB高表达细胞模型(相应设为250、500和1 000 ng剂量组),对照组为250 ng pEGFP-N1转染的L02细胞,荧光定量聚合酶链反应检测NFIB mRNA,激光共聚焦和免疫印迹法(WB)检测核因子-1(NF-1)蛋白水平.电泳迁移率实验分析与NF-1相结合的DNA序列的特异性,荧光素酶报告基因检测PP2A-B55δ亚基基因(PPP2R2D)启动子区的转录活力,RT-PCR和WB检测细胞内PPP2R2D mRNA和PP2A-B55δ蛋白水平.结果 双向测序证实pEGFP-NFIB重组表达质粒构建成功.与对照组比较,各剂量组L02细胞中NFIB mRNA相对水平增高(P＜0.01),增强型绿色荧光蛋白、NFI-B蛋白表达水平均升高(P＜0.05).NF-1可与PPP2R2D基因启动子区(2R2Dp)-462G＞A不同多态性序列结合,NFIB高表达使L02细胞中2R2Dp-462G启动子活力下降(P＜0.05),PPP2R2D mRNA和PP2A-B55δ蛋白水平均升高(P＜0.05).结论 成功构建人NFIB真核表达重组质粒,应用于人肝细胞中证实NF-1靶向PPP2R2D的功能学调控作用.