HIV-1病毒Nef基因克隆、表达、纯化及其抗体的制备

目的:运用基因工程方法制备HIV-1 Nef重组蛋白及其抗体.方法:用PCR技术从HIV-1 H×B2质粒中扩增HIV-1 Nef基因,将测序鉴定过的HIT-1 Nef基因克隆到原核表达载体pET28a( )上,应用酶切鉴定、测序、SDS-PAGE及Western blot等方法鉴定基因片段的正确性及表达蛋白的特异性.纯化的重组蛋白免疫兔3次后,ELISA法测定兔多克隆抗体滴度.用其制备的多克隆抗体通过免疫组织化学方法测定表达Nef基因的内皮细胞.结果:成功地构建了Nef基因的原核表达质粒,测序证明HIV-1 Nef基因全长为621 bp,编码206个氨基酸.在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达的重组蛋白为包涵体的形式.HIV-1 Nef蛋白N端融合6×His标签便于纯化及鉴定.获得的高纯度HIT-1 Nef融合蛋白,免疫动物后,可产生特异的高滴度抗体(ELISA滴度达1∶10000).将转染Nef基因的内皮细胞,应用免疫组化的方法证明其抗体有高度的特异性.结论:构建了高表达HIT-1 Nef蛋白的原核表达系统,制备的Nef重组蛋白免疫动物,获得了特异、高效价的抗体,为研究Nef基因的生物学活性提供了实验材料和依据.