人类免疫缺陷病毒Tat融合蛋白后的修饰与生物学活性分析

目的分析HIV Tat融合后对融合蛋白生物学活性的影响，探讨HIV Tat的生物细胞膜穿透功能和意义。方法以胸腺激酶（TK）基因为报告基因，将不同长度的甘氨酸（Gly）密码子融合在HIV Tat与TK基因之间以及两种基因倒置融合，分别克隆至PBK原核表达载体，大肠埃希菌表达，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，超声波破碎后，经耦联Tat蛋白单克隆抗体的层析柱层析收集。融合蛋白与HepG2细胞共培养，24h后间接免疫荧光检测。加用更昔洛韦，3d后锥虫蓝染色计算细胞死亡率，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。结果克隆出含有不同甘氨酸密码子的HIVTat—Gly（n）-TK（n=0，2，4，6）融合基因，成功表达Tat—TK系列融合蛋白和TK—Tat融合蛋白。间接免疫荧光检测发现Tat—TK系列融合蛋白与Tat蛋白、TK—Tat融合蛋白透过膜效率相似；但流式细胞仪检测表明，在培养基含有更昔洛韦的条件下，Tat—Gly（4）一TK、Tat—Gly（6）一TK、Tat—Gly（2）-TK、Tat—TK融合蛋白、HIVTat组和TK—Tat致HepG2细胞凋亡率分别为14．77％、4．30％、12．69％、3．OO％、1．03％和4．40％。锥虫蓝染色发现细胞死亡率也有类似结果，分别为80．2％、56．7％、65．4％、58．4％、9．1％和57．1％，组间比较差异有统计学意义（P〈0．05），但TK—Tat和Tat—TK融合蛋白组之间差异无统计学意义（P=0．24）。结论Tat与TK基因之间融合甘氨酸密码子的数目对融合蛋白中Tat的细胞融合穿透功能不产生影响，而对TK的体外细胞致死作用有较大影响，其中间隔4个甘氨酸密码子对融合蛋白TK体外细胞致死作用的影响最小，同时TK基因与HIVTat的倒置融合不影响两者生物学功能。

Construction and expression of the recombinant human immunodeficiency virus Tat gene and analysis on its biological characteristics