人MxA基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:克隆中国人MxA基因并构建含有MxA基因的重组腺病毒载体,为下一步应用其进行抗乙型肝炎基因治疗研究奠定基础。方法:从健康中国人外周血中分离单个核细胞,用Trizol试剂提取总RNA。应用逆转录PCR(RT-PCR)方法,以自行设计的引物扩增全序列MxA基因,应用基因克隆技术将MxA基因克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack(携带有绿色荧光蛋白基因)中,将线性化的pAdTrack-MxA和腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同电转化入新鲜感受态大肠杆菌BJ5183中,两者在其中完成同源重组,MxA重组腺病毒质粒经卡那霉素抗性鉴别和PacI酶切确证,验证正确的MxA重组腺病毒线性化转染入293细胞中包装成完整病毒颗粒,观察绿色荧光蛋白(GFP)表达并检测重组腺病毒的病毒滴度。结果:重组腺病毒穿梭质粒pAd-Track-MxA连接成功,测序结果表明克隆的MxA基因序列与GenBank中人MxA基因序列仅有5个核苷酸不同但所编码氨基酸仅1个发生改变,且此氨基酸位于非功能区。MxA重组腺病毒经PacI酶切后产生30kb和4.5kb大小2个片段表明同源重组成功。重组腺病毒经293细胞包装后可观察到绿色荧光,收获病毒并测感染滴度为1.59×108(pfu/ml),具有较高感染效率。结论:我们已成功克隆了中国人的MxA基因,并成功构建重组腺病毒质粒,为进一步应用此基因进行抗乙型肝炎基因治疗研究奠定了基础。

Construction and identification of the recombinant adenovirus AdMxA