hERα-LBD原核表达载体的构建及蛋白表达活性鉴定

目的 构建人雌激素受体α 亚型配体结合区（hERα-LBD）的原核表达载体，并进行表达蛋白的活性鉴定。方法 以hERα -LBD质粒为模板，采用PCR方法扩增hERα -LBD基因，PCR扩增产物鉴定后与T载体（pGEM-T-easy）连接，将连接物转化到感受态细胞中，阳性菌落经酶切和测序鉴定，和pET-28a（+）质粒分别进行双酶切，T4 DNA连接酶连接，构建重组表达载体pET-28a（+）-hERα -LBD ，转化到大肠杆菌JM109和BL21感受态细胞中。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导细胞表达hERα-LBD融合蛋白；将雌二醇-牛血清白蛋白（BSA）偶联抗原(E2-BSA) 与融合蛋白混合，通过电泳法鉴定hERα-LBD的雌激素配体结合活性。结果 PCR扩增的hERα -LBD基因片段约为1.9 kb，与预期目的片段大小一致。与T载体连接，形成pGM-T-hERα -LBD重组质粒，转化到感受态细胞，阳性菌落酶切和测序鉴定正确，与pET-28a（+）质粒酶切后连接，成功构建原核重组表达载体pET-28a（+）-hERα -LBD；在大肠杆菌中异源表达人雌激素受体ERα的配体结合区hERα-LBD蛋白。经亲和色谱法纯化后，hERα-LBD蛋白的表达量可达250 mg/L。电泳法证实hERα-LBD具有雌激素结合活性。结论 成功构建原核重组表达载体pET-28a（+）-hERα -LBD，hERα-LBD具有雌激素结合活性。