| 摘 要： | 该研究依托新疆紫草悬浮细胞转录组数据库,以CYP76B74蛋白序列为搜索序列,挖掘了2条与紫草素生物合成下游途径相关的CYP450候选基因。构建了候选基因的干扰型毛状根并进行培养,测定了鲜重、干重、总萘醌含量、紫草素类化合物含量以及紫草素生物合成途径关键酶基因的表达量,初步探究了候选基因对新疆紫草毛状根的生长和紫草素合成产生的影响,并讨论了其影响紫草素合成的可能调控机制。通过本地Blast和系统发育分析,筛选出2条新疆紫草中与CYP76B74具有高同源性的CYP450候选基因(CYP76B75,CYP76B100),并构建了相应的干扰型毛状根。相比空载毛状根(RNAi-control),CYP76B75被干扰毛状根(RNAi-CYP76B75)和CYP76B100被干扰毛状根(RNAi-CYP76B100)的鲜重显著减少,而干重未受到影响,折干率显著增加。除β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁在3组毛状根中含量都很高外,紫草素、去氧紫草素、乙酰紫草素、β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁、β-羟基异戊酰紫草素、异丁酰紫草素以及总萘醌在3组毛状根中的含量高低均呈现一致规律:RNAi-CYP76B75RNAi-CYP76B100RNAi-control。其中,干扰CYP76B75表达后对β-羟基异戊酰紫草素合成的促进作用最显著,RNAi-CYP76B75中β-羟基异戊酰紫草素的含量为RNAi-control的11.7倍。实时荧光定量PCR结果显示,与RNAi-control相比较,RNAi-CYP76B75与RNAi-CYP76B100中AePGT基因的表达量无明显变化,CYP76B74与AeHMGR的表达量上调;此外,RNAi-CYP76B75中,CYP76B100的表达量下调,而RNAi-CYP76B100中,CYP76B75的表达量反而显著上调。结果说明CYP76B75与CYP76B100被干扰表达后,毛状根的生长受到了抑制,但却显著促进了其紫草素的合成,其可能通过上调新疆紫草毛状根中CYP76B74基因的表达量调控了紫草素生物合成。
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