| 摘 要： | 目的观察小鼠心肌缺血再灌注损伤时主要骨架蛋白actin的损伤性改变,研究心肌组织中两种含量丰富的小分子热休克蛋白(HSP)-αβ-crystallin和HSP25对上述损伤的保护作用,寻找小分子HSP保护心肌损伤的可能靶蛋白.方法采用Langendorff离体小鼠心脏灌流模型,经停灌30min复灌45min导致缺血-再灌注损伤,测定心肌组织匀浆中脂质过氧化物丙二醛(MDA)的含量;运用光镜和电镜观察心肌组织形态学改变;采用免疫双荧光标记技术和激光共聚焦扫描显微镜(confocalmicroscopy)观察心肌细胞中actin的结构变化、αβ-crystallin及HSP25分布的改变及其与actin的相互关系.进一步采用适宜浓度的活性氧H2O2在体外损伤心肌组织总蛋白,损伤后蛋白质经离心取沉淀,分别或联合加入αβ-crysallin、HSP25和HSc70(组成型HSP70)后,通过Westernblot观察其对上述损伤蛋白质中的actin的解聚和复性作用.结果小鼠离体心脏缺血-再灌注损伤后,心肌组织MDA含量明显增多(P＜0.05);与正常对照组相比,光镜及电镜下可见明显的细胞结构破坏和肌原纤维损伤经免疫双荧光标记和激光共聚焦扫描显微镜观察,发现心肌细胞重要骨架蛋白actin的排列发生紊乱和异常"聚集”,αβ-crystallin和HSP25从胞浆向肌丝移位,其中HSP25与受损聚集的actin存在"共分布”的现象.经蛋白质体外损伤和保护实验进一步发现,200mmolH2O2可导致心肌组织蛋白发生变性、聚集及沉淀,而αβ-crystallin和HSP25可使上述蛋白质沉淀物中的actin重新解聚和复性而出现在上清中,且两者间具有协同的效应,当有HSc70存在时,这种协同效应更加明显.讨论及结论本研究首次观察到缺血再灌注可导致心肌组织主要的收缩蛋白和骨架蛋白actin发生排列紊乱和异常"聚集”,这种变化可能是导致缺血再灌注心脏心律失常、舒缩功能降低和细胞结构破坏的分子机制之一.本实验证实,心肌缺血再灌注时αβ-crystallin和HSP25从胞浆向肌丝移位,其中HSP25和actin"聚集物”形成"共分布”关系.此外,本实验通过蛋白质损伤和保护模型,发现两种小分子热休克蛋白对受损的actin具有解聚和复性作用,且小分子HSP之间及小分子HSP与HSc70之间具有协同的效应.上述发现提示小分子HSP可能在保护心肌损伤方面起着重要的作用,actin可能是HSP25保护的主要靶蛋白之一.另外,我们近期实验发现在上述心肌缺血再灌注损伤时αβ-crystallin有与另一细胞骨架蛋白结蛋白(desmin)形成"共分布”的现象.结蛋白是否为αβ-crystallin保护的主要靶蛋白尚待进一步研究.
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