缺氧诱导因子1α对口腔鳞状上皮癌细胞株接受放射和化学药物治疗感受性的影响

背景:缺氧诱导因子1α是一种转录因子,缺氧环境下对哺乳动物细胞起重要的调控作用。然而缺氧诱导因子1α对口腔鳞状上皮癌细胞株的放疗和化疗感受性的作用有待研究。目的:观察缺氧诱导因子1α对口腔鳞状上皮癌细胞株接受放射和化学药物治疗感受性的影响。设计:观察对比实验。单位:首都医科大学附属北京朝阳医院。材料:口腔鳞状上皮癌细胞株-2,口腔鳞状上皮癌细胞株-4,口腔鳞状上皮癌细胞株-5,和口腔鳞状上皮癌细胞株-6来自人口腔鳞状上皮癌细胞(由日本高知大学医学部口腔外科建株)。方法:本实验于2004-09/2006-08于首都医科大学附属北京朝阳医院完成。将口腔鳞状上皮癌细胞株-2,口腔鳞状上皮癌细胞株-4,口腔鳞状上皮癌细胞株-5,和口腔鳞状上皮癌细胞株-6采用含小牛血清,左旋谷酰胺,青霉素,链霉素的改良DMEM培养液中培养。①从未处理和用30Gyγ射线,100μmol/L顺铂或100μmol/L5-氟脲嘧啶处理后的口腔鳞状上皮癌细胞株中提取细胞核蛋白。采用免疫印迹法检测缺氧诱导因子1α蛋白表达水平,同时采用定量PCR检测缺氧诱导因子1αmRNA的表达。②不同干预条件下细胞增殖抑制情况:将口腔鳞状上皮癌细胞株单细胞悬液以1×104/孔接种于96孔板中,每孔分别加入终浓度为100μmol/L的顺铂或5-氟尿嘧啶,或用30Gyγ射线处理细胞,培养48h后,采用用噻唑蓝比色法检测细胞增殖抑制情况。③不同干预条件下细胞凋亡分析:口腔鳞状上皮癌细胞株细胞用30Gyγ射线,100μmol/L顺铂或100μmol/L5-氟脲嘧啶处理24h后,用Propidi-umiodide和AnnexinV-FITC染色,用流式细胞仪测定凋亡细胞数(仅分析γ射线,顺铂处理组)。④质粒构建和转染:将人缺氧诱导因子1αcDNA克隆至pcDNA3.1/V5-HisTOPO表达载体。用脂质转染法将缺氧诱导因子1αcDNA暂时转染口腔鳞状上皮癌细胞株-2细胞。将缺氧诱导因子1αsiRNA(有义序列为5’CUGAUGACCAGCAACUUGAtt3’)暂时转染口腔鳞状上皮癌细胞株-5细胞,设立空白对照,同时给予细胞增殖抑制情况观察,以及细胞凋亡分析(仅分析顺铂处理组),方法同前。主要观察指标:①不同口腔鳞状上皮癌细胞株缺氧诱导因子1α的mRNA和蛋白表达情况。②不同干预条件下口腔鳞状上皮癌细胞株增殖抑制及细胞凋亡情况。③缺氧诱导因子1α过表达或缺氧诱导因子1α基因敲除的转染细胞的蛋白水平检测。④转染细胞和对照口腔鳞状上皮癌细胞株细胞增殖抑制情况和细胞凋亡分析结果。结果:①不同口腔鳞状上皮癌细胞株间缺氧诱导因子1αmRNA和蛋白表达结果:口腔鳞状上皮癌细胞株-2,口腔鳞状上皮癌细胞株-4,口腔鳞状上皮癌细胞株-5和口腔鳞状上皮癌细胞株-6细胞缺氧诱导因子1αmRNA的相对表达水平分别为1.0,2.2,4.3和4.0。缺氧诱导因子1α的细胞总蛋白和细胞核蛋白的表达在口腔鳞状上皮癌细胞株-2和口腔鳞状上皮癌细胞株-4细胞中较弱,而在口腔鳞状上皮癌细胞株-5和口腔鳞状上皮癌细胞株-6细胞中较强。②不同干预条件下口腔鳞状上皮癌细胞株细胞增殖抑制及被诱导凋亡情况:经γ射线,顺铂及5-氟脲嘧啶处理后,口腔鳞状上皮癌细胞株-2细胞数分别下降至(39.5±3.2)%,(39.2±1.2)%和(47.9±3.6)%,口腔鳞状上皮癌细胞株-4细胞数分别下降至(53.9±6.6)%,(54.3±1.4)%,(54.8+3.8)%。口腔鳞状上皮癌细胞株-5细胞数分别下降至(74.1±3.8)%,(76.5±9.1)%,(69.6±7.7)%,口腔鳞状上皮癌细胞株-6细胞数分别下降至(71.4±7.4)%,(84.4±8.8)%,(82.0±4.5)%。顺铂处理后,口腔鳞状上皮癌细胞株-2,口腔鳞状上皮癌细胞株-4,口腔鳞状上皮癌细胞株-5和口腔鳞状上皮癌细胞株-6细胞的凋亡细胞数分别为(50.9±1.3)%,(67.3±2.2)%,(12.2±0.8)%和(38.6±0.9)%。γ射线处理后,口腔鳞状上皮癌细胞株-2,口腔鳞状上皮癌细胞株-4,口腔鳞状上皮癌细胞株-5和口腔鳞状上皮癌细胞株-6细胞的凋亡细胞数分别为(21.2±1.1)%,(14.6±0.9)%,(9.7±1.0)%和(10.4±0.8)%。③不同干预条件下转染细胞增殖抑制及凋亡情况:经γ射线,顺铂及5-氟脲嘧啶处理后,转染了缺氧诱导因子1α表达载体的口腔鳞状上皮癌细胞株-2细胞数高于对照组(t=-4.693,-8.617,-6.721,P<0.01);转染了缺氧诱导因子1αsiRNA的口腔鳞状上皮癌细胞株-5细胞数低于对照组细胞(t=5.800,5.595,4.253,P<0.05～0.01)。用顺铂处理24h后,转染缺氧诱导因子-1α的口腔鳞状上皮癌细胞株-2细胞凋亡数为(34.0±1.9)%,低于空白对照[(49.6±3.4)%,t=6.937,P<0.01]。转染缺氧诱导因子1αsiRNA的口腔鳞状上皮癌细胞株-5细胞凋亡数为(27.7±2.3)%。高于空白对照[(11.4±2.1)%,t=-8.941,P<0.01]。结论:缺氧诱导因子1α表达与口腔鳞癌细胞对放、化疗感受性之间有负相关性。抑制癌细胞的缺氧诱导因子1α表达能增强癌细胞对放疗、化疗的感受性。

Influence of hypoxia-inducible factor-1 alpha on the susceptibility of oral squamous cell carcinomas cell lines against chemotherapeutic drugs and radiation