吉西他滨促进HepG2.2.15细胞系中乙肝病毒pgRNA转录和病毒复制及相关分子机制研究

目的：探讨吉西他滨对HepG2.2.15细胞中乙肝病毒前基因组RNA（pregenomic RNA，pgRNA）转录以及乙肝病毒复制的影响及其可能的作用机制。方法：使用不同浓度吉西他滨处理HepG2.2.15细胞，分别使用CCK-8法、流式细胞术、实时定量聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）、酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）法检测细胞活性、细胞凋亡、细胞周期、细胞内乙肝病毒pgRNA、细胞培养上清液中乙型肝炎表面抗原（hepatitis B sur－face antigen，HBsAg）、乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）、乙肝病毒DNA（hepatitis B virus DNA，HBV DNA）；实时定量PCR法检测吉西他滨作用下HepG2.2.15细胞中与pgRNA转录有关的调控基因肝细胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4，HNF4α）、P38蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinase，P38MAPK）、环磷酸腺苷效应元件结合蛋白1（CAMP responsive element binding protein 1，CREB1）、核转录因子 p65（nuclear factor-kappa B p65，NF-?资b p65）、组蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylase 1，HDAC1）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子-1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha，PGC-1α）、叉头转录因子O1（forkhead box protein O1，FOXO1）、相关调控基因沉默信息调节因子2相关酶1（sirtuin 1，SIRT1）、P53 mRNA水平以及pgRNA的表达量，分析这些基因随吉西他滨浓度变化与pgRNA随浓度变化的相关性，找出与pgRNA变化相关性最高的基因，并使用Western blot在蛋白质水平验证吉西他滨对此基因蛋白质表达量的影响。结果：吉西他滨对HepG2.2.15细胞的生长显示出浓度以及剂量依赖性的抑制作用；吉西他滨使细胞凋亡率增高；吉西他滨使细胞更多的细胞停滞在G0G1期，而处于S期细胞比例降低；吉西他滨明显增加HepG2.2.15细胞内乙肝病毒 pgRNA，72 h之内呈现明显的时间与剂量依赖性；吉西他滨作用细胞24 h会使细胞培养上清液中的HBeAg增加；吉西他滨促进HNF4α mRNA、HNF4α蛋白质表达量增加，且在所检测的与乙肝病毒转录调节有关的基因中，HNF4α mRNA变化趋势与HBV pgRNA变化趋势相关性最高。结论：吉西他滨可在细胞水平促进乙肝病毒pgRNA转录以及乙肝病毒的复制，其机制为通过促进乙肝病毒转录因子HNF4α的表达实现的。

Gemcitabine promotes hepatitis B virus pgRNA transcription and viral replication in HepG2.2.15 cells and related molecular mechanisms