L型钙通道在"李氏方"水提液保护神经元过程中的作用及该水提液最佳剂量

目的:观察L型钙通道在“李氏方”保护神经元中的作用,并找出“李氏方”水提液最佳作用剂量。方法:实验于2004-09/2005-08在南方医科大学神经生物学教研室完成。①用MTT法观察不同质量浓度0(对照组),0.0625,0.125,0.25,0.5,1.0,2.0,4.0,8.0g/L“李氏方”(主要成分有龟甲、地龙、石菖蒲、当归及酸枣仁等)水提液分别作用正常条件下培养了9d的新生大鼠海马神经元24h的细胞成活率;用Hoechst33258荧光染料标记凋亡的细胞,镜下数三四个视野的总细胞及凋亡细胞数,计算细胞凋亡率(凋亡细胞数占细胞总数的百分比)。②借助于共聚焦显微镜和钙荧光指示剂Fluo-3/AM,在海马神经元细胞培养至第8天加处理因素[单纯加入5μmol/L的L型钙通道阻断剂尼氟的平;单纯加入不同质量浓度的“李氏方”水提液及尼氟的平(5μmol/L) 不同质量浓度“李氏方”水提液共同作用]继续培养24h用于实验和细胞培养至第9天观察干扰因素的急性作用。用钙成像技术测定培养的神经元胞浆的荧光值(用30mmol/L的氯化钾诱导细胞内钙的变化)及钙浓度。③借助于膜片钳全细胞记录技术,观察“李氏方”水提液对L型钙电流的影响。④计量资料差异性比较采用方差分析中的LSD和SNK分析。结果:①0.0625～2g/L的质量浓度范围“李氏方”水提液明显提高正常培养下的海马神经元的成活率,浓度为0.5g/L细胞成活率增加最大。经5μmol/L的尼氟的平预处理后,“李氏方”水提液增加神经元成活率的效应明显降低。②“李氏方”水提液明显增加L型钙电流,经尼氟的平预处理后,“李氏方”水提液增加L型钙电流的效应显著降低。③正常培养条件下的海马神经元胞浆游离钙浓度在(75.67±8.65)nmol/L(对照组)。“李氏方”水提液作用24h后,细胞内游离钙浓度提高到(126.35±9.35)nmol/L,明显高于正常培养条件下的(P<0.05)。经尼氟的平作用24h,游离钙降到(40.65±5.65)nmol/L,明显低于正常培养条件下的(P<0.05)。“李氏方”水提液与尼氟的平共同作用24h后,细胞游离钙浓度降到(90.75±10.15)nmol/L,明显低于单纯“李氏方”水提液作用(P<0.05)。④对正常培养的细胞负载Fluo-3/AM45min后,加尼氟的平预处理10min,30mmol/L的KCl导致的荧光强度比尼氟的平预处理前明显降低,而“李氏方”水提液预处理10min,30mmol/L的KCl导致的荧光强度比“李氏方”水提液预处理前明显升高。尼氟的平预处理10min后,“李氏方”水提液再预处理10min,30mmol/L的KCl导致的荧光强度比“李氏方”水提液预处理的降低,与单纯“李氏方”水提液预处理比较,差异明显(P<0.05)。结论:“李氏方”水提液可通过增加L型钙通道活动,导致胞浆游离钙增加而促神经元的成活,且效果最佳的浓度为0.5g/L。

Effect of L-type calcium channel in liquid extract from li shi formula in protecting neurons and its optimal dosage