靶向沉默CXCR4基因抑制肝细胞癌侵袭体外研究

目的:采用RNAi技术构建CXCR4shRNA干扰载体,探讨靶向沉默CXCR4基因表达后对人肝细胞癌增殖和侵袭作用的影响及可能机制。方法:通过蛋白质印迹法和RT-PCR,检测不同分化程度的肝癌细胞株CXCR4表达程度。通过RNAi技术,将CXCR4shRNA干扰载体转染CXCR4高表达的肝癌细胞HepG2,并采用G418筛选出稳定表达株,蛋白质印迹法和RT-PCR验证shRNA对CXCR4基因的靶向沉默效率。以转染空载体细胞为阴性对照组,MTT法检测CXCR4基因沉默后肝癌细胞的增殖能力,Transwell小室侵袭试验检测CXCR4基因沉默后肝癌细胞的侵袭能力,蛋白质印迹法检测MMP-2和MMP-9蛋白表达水平,免疫荧光检测MMP-2在细胞内表达。结果:CXCR4靶向沉默的细胞CXCR4表达受到显著抑制。HepG2、HepG2-Vector和HepG2-CXCR4-细胞CXCR4蛋白相对表达量分别为0.56±0.07、0.54±0.04和0.14±0.05,F=57.42,P<0.001。正常HepG2、HepG2-Vector和HepG2-CXCR4-细胞的CXCR4mRNA相对表达量分别为1.04±0.05、1.05±0.11和0.19±0.03,P<0.001。MTT结果显示,CXCR4基因沉默能明显抑制HepG细胞的增殖。72h时正常HepG2、HepG2-Vector和HepG2-CXCR4-细胞的相对增殖速度分别为1.34±0.05,1.32±0.03和1.14±0.03。Transwell试验显示,10%FBS趋化作用下,HepG2、HepG2-Vector和HepG2-CXCR4-穿膜细胞数分别为85±13、89±17和23±6,差异有统计学意义,F=63.91,P<0.001;SDF-1趋化作用下,HepG2、HepG2-Vector和HepG2-CXCR4-穿膜细胞数分别为168±20、171±24和30±9。蛋白质印迹法显示,相对于正常HepG2细胞(0.83±0.04),HepG2-CXCR4-细胞MMP-2相对表达量(0.31±0.06)明显下降,P<0.001;而HepG2-Vector细胞MMP-2相对表达量(0.85±0.07)改变不明显,P=0.75。HepG2、HepG2-Vector和HepG2-CXCR4-细胞MMP-9相对表达量分别为0.35±0.04、0.33±0.07和0.32±0.06,差异无统计学意义,F=0.23,P=0.79。结论:通过RNAi技术成功靶向干扰CXCR4基因表达,可抑制肝癌细胞增殖和侵袭,可能与其抑制侵袭相关分子MMP-2表达有关。