中波紫外线诱导人皮肤成纤维细胞自噬对凋亡影响的初步研究

[目的]探讨不同剂量中波紫外线(UVB)照射人皮肤成纤维细胞诱导的自噬对细胞凋亡活性的影响.[方法]人皮肤成纤维细胞来自于23岁健康男性环切术后包皮的原代培养,连续传代培养后取第3～ 10代的细胞进行实验.通过单丹酰戊二胺(MDC)染色和免疫荧光标记微管相关蛋白1轻链3(LC3)的方法,确定不同剂量3-甲基腺嘌呤(3-MA)对自噬的抑制作用.UVB照射后立即加入0.5 mmol/L 3-MA孵育细胞4h作为自噬的抑制方法.Hoechst和碘化丙啶(PI)染色结合Annexin V-异硫氰酸荧光索(FITC)和PI标记细胞后流式细胞仪检测作为细胞凋亡的定性和定量方法.[结果]0.5 mmol/L 3-MA能明显抑制人皮肤成纤维细胞自噬活性(饥饿诱导组自噬细胞阳性百分数为63.037％±5.876％,3-MA孵育后下降至34.425％±5.183％).空白对照组、30、50、100mJ/cm2UVB照射组标记LC3绿色荧光信号逐渐增强,照射后立即对上述4组加入3-MA孵育4h则LC3蛋白表达差异不明显.0.5 mmol/L 3-MA对细胞活性影响最小.50 mJ/cm2 UVB照射下加入3-MA孵育较未加3-MA孵育细胞强Hoechst和强PI双染细胞增多；100 mJ/cm2 UVB照射后加3-MA孵育较未加3-MA孵育细胞强Hoechst和强PI双染细胞减少.Annexin V -FITC和PI标记细胞后流式细胞仪分析显示,在50 mJ/cm2 UVB照射下,抑制自噬的细胞中晚期凋亡水平[( 10.933±0.839)％]较未抑制细胞[(7.267±0.473)％]上升,两者之间差异具有统计学意义(t=5.20,P＜ 0.05)；而在100mJ/cm2UVB照射下,抑制自噬的细胞中晚期凋亡水平[(7.100±0.781)％]较未抑制细胞[( 10.133±0.681)％]下降,两者之间差异具有统计学意义(t=6.29,P＜ 0.05).[结论]50 mJ/cm2 UVB照射诱导人皮肤成纤维细胞自噬通过抑制凋亡对细胞起到保护作用,而在100 mJ/cm2 UVB照射下发生的较高水平自噬可能诱导了自噬性细胞死亡.

Effects of ultraviolet B-induced autophagy on apoptosis in human skin fibroblasts: a preliminary study