SOE法构建甲状腺自身免疫ScFv基因

目的甲状腺自身免疫疾病(AITD)的患者血中有多种抗甲状腺自身抗体.为了构建单链抗体(ScFv)库以获得抗甲状腺ScFv,首先需要构建ScFv基因,我们利用重叠延伸拚接(SOE)法,制备了人源ScFv基因,为建立ScFv库和进一步研究AITD的发病机制及分析甲状腺自身抗体的作用打下基础.方法分离Graves病人血中的单个核细胞.提取总RNA,逆转录合成cDNA.参照文献报道设计引物,重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的引物均采用兼并序列引物,VH5′引物和VL3′引物带有27个互补碱基的接头(linker)编码序列.VL3′引物插入Spel内切酶位点,VH5′引物插入Sacl内切酶位点.先分别通过PCR扩增VH和VL,将纯化的VH和VL扩增产物按照一定比例混合,利用VH和VL互补序列,做15次PCR循环,合成出完整的ScFv基因,再以VH3′和VL5′引物进行PCR获得更多的ScFv基因产物,将ScFv基因重组到p3SCMH噬菌粒中,并做酶切鉴定.结果用PCR扩增VH和VL基因,PCR产物做电泳鉴定,经1.5%琼脂糖凝胶电泳,在380bp和420 bp左右有特异扩增带.将VH和VL的PCR产物用低溶点胶电泳纯化,并分别做DNA定量,将VH和VL的量调整为不同的比例做SOE,制备ScFv基因.PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳显示在800 bp左右有特异扩增带.纯化后的PCR产物,用Sacl+Spel双酶消化后,重组到噬菌粒中,转入XL1-blue大肠杆菌中扩增,再以提纯的重组噬菌粒做模板以VH3′引物和VL5′引物做PCR扩增,同时对重组噬菌粒做双酶切鉴定.琼脂糖凝胶电泳显示,两种鉴定方法均在800bp处有特异条带,证明ScFv连接成功.结论构建未知亲本抗体的ScFv常采用两种方法,一种是将Linker设计在表达载体上,两端各有限制性内切酶位点供VH和VL插入;另一种方法即本文使用的SOE法.前者操作繁杂,而SOE法虽然操作相对简单但不容易成功,它要求VH和VL的量要有严格的比例.由于纯化的VH和VL做准确定量有困难,我们的体会是做SOE时将VH和VL的量以不同的比例混合,以增加成功率.一般认为Linker长度以14～25个氨基酸残基为宜.本文采用的15肽序列(Gly4Ser)3是目前使用最广泛的Linker.本实验制备的ScFv基因已经成功的构建了噬菌体抗体库,并筛选出TRAb噬菌体抗体.