| 人生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1基因重组慢病毒RNA干扰载体的构建及鉴定 |
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| 引用本文： | 张金池,李文献,欧阳亮远,吴霖,张连芳,肖萌.人生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1基因重组慢病毒RNA干扰载体的构建及鉴定[J].中华实验外科杂志,2015,32(2). |
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| 作者姓名： | 张金池 李文献 欧阳亮远 吴霖 张连芳 肖萌 |
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| 作者单位： | 福建医科大学附属第一医院血管外科福建医科大学血管与腔内血管外科研究室,福州,350005 |
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| 基金项目： | 福建医科大学教授基金资助项目 |
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| 摘 要： | 目的 探讨构建人类生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1(Gab1)基因重组慢病毒RNA干扰载体的方法,研究其对人脐静脉血管内皮细胞株EA.hy926的沉默效率.方法 针对人类Gab1基因设计5个靶点的小干扰RNA (siRNA)序列,并分别合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa I和Xho I限制性内切酶双酶切后的GV118载体连接,产生Gab1-RNA干扰(RNAi)转化子,聚合酶链反应(PCR)筛选阳性克隆并进行测序鉴定.将测序正确的Gab1-RNAi、pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共转染239T细胞,包装产生LV-Gab1-RNAi慢病毒并测定其滴度.将获得的慢病毒分别转染EA.hy926细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,测定其转染效率;通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后的EA.hy926细胞中Gab1 mRNA表达水平来验证慢病毒干扰载体的基因沉默效率.结果 经PCR分析和测序证实,成功构建LV-Gab1-RNAi慢病毒载体;病毒滴度为3×109 TU/ml;荧光显微镜下转染组细胞GFP荧光表达强烈,转染效率达70％以上;RT-PCR证实干扰组细胞Gab1 mRNA表达水平(0.088 ±0.003)较对照(0.947±0.087)组和空白组(0.999±0.067)显著降低(P＜0.01).结论 成功构建人Gab1基因RNAi慢病毒载体并能在293T细胞中扩增获得足够的病毒滴度,能明显抑制Gab1基因在EA.hy926细胞株中的表达.
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| 关 键 词： | 生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1 RNA干扰 慢病毒载体 基因重组 |
Construction and identification of human growth factor receptor binding protein 2 associated binding 1 gene recombinant lentivirus RNA interference vector |
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| Zhang Jinchi,Li Wenxian,Ouyang Liangyuan,Wu Lin,Zhang Lianfang,Xiao Meng.Construction and identification of human growth factor receptor binding protein 2 associated binding 1 gene recombinant lentivirus RNA interference vector[J].Chinese Journal of Experimental Surgery,2015,32(2). |
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| Authors: | Zhang Jinchi Li Wenxian Ouyang Liangyuan Wu Lin Zhang Lianfang Xiao Meng |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | Growth factor receptor binding protein 2 associated binding 1 RNA interference Lentiviral vector Gene recombination |
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