新生大鼠许旺细胞体外培养纯化的最佳培养条件

背景:许旺细胞对促进外周神经的生长,发育和修复有重要作用,目前对于许旺细胞体外培养方法的优劣情况报道不一.目的:筛选许旺细胞最佳体外培养条件.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-06/10在武汉大学人民医院中心实验室完成.材料:三四天龄SD大鼠24只,由武汉大学医学部实验动物中心提供.方法:无菌剥离大鼠双侧坐骨神经,应用低浓度酶快速消化法、差速贴壁法分离培养纯化许旺细胞.取处于指数生长期的细胞,调整密度为1×107 L-1接种到6孔培养板,然后分组实验.设定4个条件:培养基pH(6.8～8.8)、胎牛血清体积分数(2%～20%)、培养箱温度(34～39℃)、培养箱CO2浓度(3%～8%).首先固定胎牛血清体积分数、培养箱温度和培养箱CO2浓度,改变培养基pH对细胞进行培养,从而确定最适培养基pH.然后依次改变胎牛血清体积分数、培养箱温度以及培养箱CO2浓度,进而得到其他3个指标的最佳值.镜下观察见明显克隆形成时终止培养,以含5个以上细胞的细胞团作为1个克隆,在倒置显微镜下进行克隆计数.主要观察指标:通过许旺细胞长势及克隆形成情况,筛选许旺细胞体外培养扩增的最适pH、胎牛血清体积分数、培养温度和培养箱CO2浓度.结果:在以DMEM/F12(1:1)为基础培养基的情况下,培养基pH为7.0～7.2时克隆形成最多,＜7.0或＞7.2时克隆形成明显下降:胎牛血清体积分数为10%许旺细胞长势较好且克隆数明显增加,当血清浓度过高或过低时克隆形成相对较差;34～36℃细胞生长受到明显抑制,克隆形成较少,37℃时克隆形成最多,＞37℃细胞长势开始变差,克隆形成下降,至39℃时细胞已无法贴壁民;培养箱CO2浓度为3%～8%时许旺细胞克隆形成无明显变化.结论:许旺细胞体外培养的最佳条件为pH7.2的DMEM/F12(1:1)细胞培养基、胎牛血清体积分数10%、培养箱温度37℃、培养箱CO2浓度5%.

Optimized conditions for growth and in vitro purification of neonatal rat Schwann cells