真核载体pcDNA3.1/PSD95-PDZ2的构建、表达及功能鉴定

目的构建含突触后密度蛋白-95(PSD95)的第2个盘状同源区域(PDZ2)的真核载体pcDNA3.1/PSD95-PDZ2,并检测其在鼠嗜铬细胞瘤细胞株(PC12)中的表达和功能。方法采用RT-PCR法从小鼠神经元细胞的cDNA中,扩增出约309 bp的PSD95-PDZ2基因片段。用EcoRⅠ、BamH I将片段和载体pcDNA3.1双酶切后,酶切产物加入T4 DNA连接酶16℃连接过夜,构建真核表达载体pcDNA3.1/PSD95-PDZ2。用双酶切、DNA序列分析鉴定正确后,采用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将其转染PC12细胞,IP法检测目的片段在细胞中的表达与功能。结果阳性克隆经双酶切法鉴定含有PSD95-PDZ2基因片段,基因测序结果与GenBank中序列相同。IP检测出11 ku大小的蛋白,证明目的基因在PC12细胞中可以正常表达并与神经元性一氧化氮合酶(nNOS)结合。结论真核载体pcDNA3.1/PSD95-PDZ2构建成功,目的片段PSD95-PDZ2在PC12细胞中可正常表达并与nNOS结合,为进一步研究其作用奠定了基础。