银杏内酯和神经生长因子影响原代人胚肝细胞的增殖及分泌

目的:如何培养足够的肝细胞以及应用一些物质、因子从而使其增加分裂、减少凋亡?观察银杏内酯和神经生长因子对体外原代培养的人胚肝细胞增殖、凋亡及相关分泌功能的影响具有临床实用性意义。方法:实验于2005-07/2006-10在南通大学神经生物学研究所完成。①细胞来源:孕14～16周流产胎儿,由南通市妇幼保健院妇产科提供,产妇及其家属均知情同意,实验经医学伦理委员会批准。银杏内酯由中国药科大学提供,神经生长因子为Roche公司产品。②实验方法:用非灌流法从人胚肝中分离肝细胞,以DMEM作为培养基,接种于4块24孔培养板中,每两块培养板各接种36孔,12孔/组,细胞3×105/孔。银杏内酯组各孔加入含37.5g/L银杏内酯和体积分数为0.1小牛血清的DMEM培养液2mL,神经生长因子组各孔加入含100mg/L神经生长因子和体积分数为0.1小牛血清的DMEM培养液2mL,空白对照组各孔加入仅含体积分数为0.1小牛血清的DMEM培养液2mL。③实验评估:人胚肝细胞原代培养至9d,倒置显微镜下计数每视野的肝细胞数,同时行MTT试验,并用流式细胞仪检测肝细胞凋亡情况。分别于培养3,6,9d时收集肝细胞培养液进行白蛋白含量检测。结果:①原代肝细胞生长情况及肝细胞计数:接种12h后各组肝细胞均已贴壁,3d后可见由3～5个细胞组成的细胞集落,至9d时银杏内酯组和神经生长因子组肝细胞已基本铺满孔底,且呈立体生长倾向,空白对照组肝细胞较少,胞间有空隙存在。至培养9d,银杏内酯组、神经生长因子组、空白对照组每视野内肝细胞计数差异有显著性意义(F=12.97,P=0.00)。②MTT试验结果:原代肝细胞培养至9d时,银杏内酯组、神经生长因子组、空白对照组吸光度值差异有显著性意义(F=71.90,P=0.00)。③肝细胞培养液白蛋白含量:培养3d时各组细胞培养液的白蛋白含量方差分析无明显差异(F=0.23,P=0.79)。培养6,9d同一时间点组间比较差异有显著性意义(F=11.69,P=0.00;F=9.35,P=0.00)。④细胞凋亡情况:银杏内酯组、神经生长因子组、空白对照组凋亡肝细胞百分率分别为11.53%,9.29%,15.27%。结论:银杏内酯和神经生长因子对原代人胚肝细胞的增殖和分泌白蛋白功能均具有促进作用,并抑制细胞凋亡。

Ginkgolide and nerve growth factor influence the proliferation and secretion of primary human embryonic hepatocytes