| pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP真核表达载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达 |
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| 引用本文： | 李杰,蒋树林,刘英杰,田海,孙露,李仁科. pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP真核表达载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达[J]. 中国胸心血管外科临床杂志, 2007, 14(2): 126-131 |
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| 作者姓名： | 李杰 蒋树林 刘英杰 田海 孙露 李仁科 |
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| 作者单位： | 1. 哈尔滨医科大学附属第二医院,心外科,哈尔滨,150086
2. 加拿大多伦多大学多伦多总医院 心血管外科,M5G2C4 |
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| 摘 要： | 目的 构建标记有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的人基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(hTIMP-1)真核表达质粒pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP,并通过转染大鼠血管平滑肌细胞(SMCs)验证hTIMP-1的表达.方法 将hTIMP-1及编码EGFP的互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列通过扩增、酶切、插入pcDNA3.1质粒的多克隆位点,构建pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP真核表达质粒;应用脂质体介导的基因转染技术,将基因导入SMCs(pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP转染组).应用荧光显微镜观察EGFP的表达情况;流式细胞仪检测转染效率;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹法(Western blotting)等方法检测hTIMP-1的表达情况;明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9活性.用空质粒pcDNA3.1转染SMCs(空质粒pcDNA3.1转染组)和未转染质粒的SMCs(未转染组)作为对照.结果 pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP转染组重组质粒转染SMCs后,SMCs生长受到抑制;转染24 h后在荧光显微镜下可见强绿色荧光,流式细胞仪检测转染效率约为15%;RT-PCR检测结果显示,SMCs出现646 bp目的基因;Western blotting检测显示,在转染后的血管SMCs中有hTIMP-1表达;明胶酶谱法检测结果显示,MMP-2、MMP-9活性降低;与空质粒pcDNA3.1转染组和未转染组比较差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 TIMP-1真核表达质粒的构建和在血管SMCs中的表达,为TIMP-1基因治疗的研究奠定了基础.
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| 关 键 词： | 基质金属蛋白酶组织抑制因子 真核表达载体 平滑肌细胞 |
| 文章编号： | 1007-4848(2007)02-0126-06 |
| 修稿时间： | 2006-12-05 |
Construction of Eukaryotic Expression Plasmid of pcDNA3.1/Human Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1-Enhanced Green Fluorescent Protein and Its Expression in Vascular Smooth Muscle Cells |
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| LI Jie,JIANG Shu-lin,LIU Ying-jie,TIAN Hai,SUN Lu,LI Ren-ke. Construction of Eukaryotic Expression Plasmid of pcDNA3.1/Human Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1-Enhanced Green Fluorescent Protein and Its Expression in Vascular Smooth Muscle Cells[J]. Chinese Journal of Clinical Thoracic and Cardiovascular Surgery, 2007, 14(2): 126-131 |
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| Authors: | LI Jie JIANG Shu-lin LIU Ying-jie TIAN Hai SUN Lu LI Ren-ke |
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